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下面是我們在檢測霉菌酵母時(shí)遇到的幾個(gè)問題：
1、計(jì)數(shù)前的鑒定
計(jì)數(shù)霉菌酵母結(jié)果前是需要鑒定菌落是否是真菌的。
霉菌的形態(tài)相對比較明顯，不容易被混淆。但是對于酵母來說，培養(yǎng)基里抑制細(xì)菌的成分，例如氯霉素在此的劑量不足以抑制所有的細(xì)菌種類。部分細(xì)菌會在孟加拉紅培養(yǎng)基上生長的也很好，如下圖：
被紅色圓圈圈起來的菌落是不是很像酵母？然而這只是一種革蘭氏陽性的球菌而已，是細(xì)菌。
簡單來說，真菌比細(xì)菌大得多。鏡檢如果使用低倍鏡（10-40倍）就可以清晰觀察到菌的輪廓，那么就是真菌。相反，如果需要油鏡等高倍鏡（1000倍以上），那就是細(xì)菌。
2、不同形態(tài)的菌落做鏡檢
“不同”形態(tài)的菌落，這個(gè)“不同”也是有區(qū)別的。如下圖所示：
圖2中紅色和藍(lán)色圓圈內(nèi)的這兩種“不同”形態(tài)的菌落，差別太大，確實(shí)是不相同的種類。
圖3中的四個(gè)“不同”的形態(tài)的菌落，其實(shí)是同一種酵母，這是釀酒酵母菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株在孟加拉紅培養(yǎng)基上因?yàn)樯L位置不同而體現(xiàn)出的差異。生長在瓊脂表面的菌落，白色透粉紅、圓形；生長在瓊脂內(nèi)部的菌落，出現(xiàn)菱形或花瓣形；生長在瓊脂底部和平皿接觸面上的菌落，呈現(xiàn)出較深粉紅色的圓形。
使用傾注法，同一種酵母可能會出現(xiàn)不同的形態(tài)。因此，挑取有代表性的菌落做鏡檢，我們要慎之又慎。不然會做重復(fù)工作或漏檢。
3、是否必須培養(yǎng)5天
在GB 4789.15-2016 中把“培養(yǎng) 5 d，觀察并記錄”修改為“觀察并記錄培養(yǎng)至第 5 d 的結(jié)果。”
部分霉菌適宜生長的溫度稍高，如煙曲霉等，如果依然使用28℃培養(yǎng)，酶的催化活性降低，代謝速度減慢，繁殖就會慢，就不能提前計(jì)數(shù)。還有幾類霉菌:毛霉、犁頭霉、木霉等生長快、菌絲多，最好在48小時(shí)以內(nèi)計(jì)數(shù)，否則菌絲就會覆蓋整個(gè)平皿，無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
另外，有的菌株如果培養(yǎng)時(shí)間不足，形態(tài)特征會不明顯，不容易區(qū)分鑒別，因此需要延長培養(yǎng)時(shí)間。
4、標(biāo)準(zhǔn)方法與快檢方法相比
依據(jù)GB 4789.15-2016 ，食品實(shí)驗(yàn)室檢測霉菌酵母的時(shí)間在很多情況下顯得過長，這也是近年來快速檢測方法需求大增的原因。很多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行快檢產(chǎn)品驗(yàn)收時(shí)，通過對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用黑曲霉菌和釀酒酵母菌，在孟加拉紅瓊脂上生長速度也很快，大約2-3天就可以報(bào)告結(jié)果，和一些快檢方法相當(dāng)。
《GB 4789.28—2013 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》附錄E中要求，實(shí)驗(yàn)室常備驗(yàn)收孟加拉紅瓊脂或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基所使用的霉菌酵母的標(biāo)準(zhǔn)菌株為黑曲霉菌和釀酒酵母菌，因此大部分實(shí)驗(yàn)室如果做國標(biāo)法和快檢方法的對比實(shí)驗(yàn)，往往使用的也是這兩種菌株。
但是我們要知道，GB 4789.28—2013 中附錄E，半定量質(zhì)控評定標(biāo)準(zhǔn)G值所采用的質(zhì)控菌株（目標(biāo)菌），生長繁殖速度相對較快，特征明顯。以釀酒酵母菌為例，如果對純菌液樣液（無抑制成分、無干擾菌）傾注孟加拉紅瓊脂，28℃下培養(yǎng)48-72h就足以計(jì)數(shù)，繼續(xù)培養(yǎng)也不過是使菌落變的更大。如果培養(yǎng)溫度升高1-2℃，這一速度還將更快。同理，黑曲霉菌3天也已經(jīng)足夠。
現(xiàn)有的類似培養(yǎng)基培養(yǎng)的快檢方法，如3M霉菌酵母快速檢測紙片，或者Biokar霉酵快速顯色培養(yǎng)基等檢測霉酵的時(shí)間大都為2-3天，這樣一來，對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往在培養(yǎng)2-3天后就可以全部觀察到，會給人造成一種錯(cuò)覺：經(jīng)過國際權(quán)威組織認(rèn)證的快速檢測方法，檢測時(shí)間和孟加拉紅瓊脂差不多，那么日常檢測中，培養(yǎng)了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長菌，是不是就可以下結(jié)論了呢？
實(shí)際上，培養(yǎng)了3天左右的孟加拉紅瓊脂上未長菌，在第四天或第五天開始出現(xiàn)霉菌酵母的情況是存在的。
以《SN/T 3266食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》為例，對非標(biāo)方法（定量）選擇性的要求就包括：包容性≥98% （30個(gè)目標(biāo)菌株）,并不能以某種菌株的結(jié)果代表所有情況。
在本文前面已經(jīng)提到，霉菌酵母的種類非常之多，GB 4789.15中將培養(yǎng)時(shí)間定在5天，也是考慮到在此培養(yǎng)條件下生長繁殖比較緩慢的情況。除少情形（培養(yǎng)時(shí)間過長會導(dǎo)致蔓延等）外，培養(yǎng)時(shí)間一定要足夠。
Symphony 瓊脂可對所有人類和動物食品中的酵母菌和霉菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，與其水活性無關(guān)。也可用于生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境樣品的控制。該方法允許在54小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，而不是使用標(biāo)準(zhǔn)方法的5天。
