亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌是梭狀芽胞桿菌屬的一群細菌，而不是一個生物學(xué)分類單位。多指厭氧芽胞桿菌，代表性菌株是致黑梭狀芽胞桿菌，其他常見的還有產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風(fēng)梭菌等。此類細菌的主要特征是將亞硫酸鹽還原為硫化物，多為有動力的革蘭氏陽性菌，可形成芽胞，厭氧生長。

　　厭氧亞硫酸鹽還原菌的孢子在自然環(huán)境中廣泛存在，通常出現(xiàn)在人和動物的糞便排泄物，廢水和土壤中。與大腸桿菌和其它桿菌不同的是，由于它們的孢子比營養(yǎng)體對物理和化學(xué)因子具有更強的抵抗力，所以可以在自然環(huán)境中存活很大時間。因而，通常將他們作為長期污染或間斷污染的指示菌。它們甚至可以抵抗正常水處理所用氯的工作濃度，因此，它們對判斷是否已達到控制目的非常有用。

　　由于此類細菌抵抗力強，即使在經(jīng)適當(dāng)加工處理的加工食品中其芽胞仍會存活，條件適宜時又會生長繁殖，造成食品品質(zhì)降低或腐敗，甚至?xí)�引起食物中毒的危險。因此在食品的制備、貯存以及食品加工廠環(huán)境衛(wèi)生控制上頗受重視，作為食品、礦泉水、加工設(shè)備衛(wèi)生、生產(chǎn)環(huán)境的衛(wèi)生狀況的評估指標(biāo)，正確得到越來越廣泛的應(yīng)用。

　　該類細菌的檢測多用于環(huán)境水質(zhì)和生活飲用水污染狀況的評估，在九十年代中后期開始在食品衛(wèi)生領(lǐng)域中有所要求，但多局限于歐洲國家和地區(qū)，如法國、瑞士、英國、捷克等歐盟成員國。到目前為止，該菌一般不被作為食品衛(wèi)生常規(guī)檢測項目和致病菌檢測內(nèi)容，我國和美國未將該檢測項目列入食品微生物檢測項目和要求中。

　　由于此類細菌以形成芽胞、厭氧生長和還原亞硫酸鹽為硫化氫為主要特征，往往無需作進一步實驗驗證，因此在檢測中將滿足以上三個條件的一群細菌全部認定為厭氧亞硫酸鹽還原菌。

　　檢測方法一般包括以下三部分：檢樣在接種前在80-100℃水浴中處理10-15分鐘，以殺滅抵抗力弱的芽胞細菌的營養(yǎng)體，同時刺激芽胞的繁殖；通過選擇性培養(yǎng)如亞硫酸鐵鹽瓊脂等判定是否具有還原亞硫酸鹽的能力，如果有則進一步與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽如枸櫞酸鐵反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)黑色；培養(yǎng)基接種后置于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)確認厭氧特征。也可在培養(yǎng)基中加入抗生素等抑制劑抑制其它非亞硫酸鹽還原菌的生長。

　　下面詳細介紹亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗方法。

1.培養(yǎng)基和試劑

1.1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液

1.2 亞硫酸鐵瓊脂

1.3 過氧化氫試劑

2.儀器和設(shè)備

2.1 均質(zhì)器:用于處理固體樣品

2.2培養(yǎng)罐（箱）,帶產(chǎn)生厭氧環(huán)境的設(shè)備或試劑

2.3 恒溫培養(yǎng)箱:37±1℃或46±1℃

2.4 振蕩器

2.5 吸管:1mL、10mL,具0.1mL刻度

2.6 培養(yǎng)皿:直徑為90mm

2.7 稀釋瓶:容量為500mL和250mL的廣口瓶

2.8 天平:感量0.1g

3.抽樣和試樣制備

3.1 抽樣

　　參照SN0330-94規(guī)定抽樣

3.2試樣制備

　　無菌操作稱取剪碎后的樣品25g,置于裝有225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的廣口瓶中。若檢測亞硫酸鹽還原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min熱處理樣品,之后以流水迅速冷卻至室溫后再稱取。充分混勻后據(jù)樣品污染情況做進一步的系列十倍梯度稀釋。

4.檢驗步驟與計數(shù)

4.1菌落計數(shù)法

　　適用于檢查未經(jīng)加工處理的生鮮食品及亞硫酸鹽還原梭菌計數(shù)>10g(mL)的食品。

4.1.1接種和培養(yǎng)

4.1.1.1對每一份試樣，選用適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1 mL，一式雙份地接種于每個滅菌的培養(yǎng)皿中。

4.1.1.2 傾注約15 mL制備好的并于水浴箱保溫至45℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備最初稀釋液結(jié)束到傾注培養(yǎng)基于最后一個平皿所用的時間不應(yīng)超過15min。仔細將接種物和培養(yǎng)基充分混勻，水平放置，使其凝固。

4.1.1.3待混合物凝固后，在傾注10 mL同樣的培養(yǎng)基于已凝固的培養(yǎng)基上作為隔層以防氧吸附，并防止細菌蔓延生長。

4.1.1.4 待該隔層凝固后反轉(zhuǎn)制備好的平板，于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。若對培養(yǎng)溫度有特殊要求（如46℃），可依據(jù)情況進行培養(yǎng)。

4.1.2計數(shù)

4.1.2.1亞硫酸鹽還原梭菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厭氧培養(yǎng)24h后，計數(shù)典型的菌落；若平板上無特征性菌落或菌落較�。�<0.5mm），則需繼續(xù)培養(yǎng)24h再計數(shù)；若48 h后的菌落增大以至相連，則以24 h的計數(shù)為準(zhǔn)，反之則以48h為準(zhǔn)。

　　那些僅產(chǎn)生氫（而不是H₂S）的厭氧菌生長時也可還原亞硫酸鹽而導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)彌散的、非典型的普遍變黑，這種現(xiàn)象不應(yīng)計數(shù)。

4.1.2.2取特征性菌落（不少于5個）移種于皰肉培養(yǎng)基中，37±1℃厭氧培養(yǎng)24-72 h。待出現(xiàn)生長特征（培養(yǎng)液渾濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味）后，按5條進行證實試驗。對陽性結(jié)果進行計數(shù)。

4.1.2.3讀取帶有10-100個黑色菌落的平皿，結(jié)果以相應(yīng)稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)來計算每克樣品中亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)。結(jié)果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

　　若相應(yīng)測試試樣的兩個平板上均無特征性菌落，以<10/g(mL)報告

4.2最近似值（MPN）法

　　適用于檢查亞硫酸鹽還原梭菌計數(shù)≤10 g(mL)及含有受損傷的亞硫酸鹽還原梭菌的加工食品。

4.2.1接種和培養(yǎng)

4.2.1.1增菌

　　選用適宜的三個連續(xù)稀釋的樣液，從每個樣液中分別吸取1mL，一式三份地接種于3管裝有皰肉培養(yǎng)基的試管中,接種后上面覆蓋一層無菌的液體石蠟，37±1℃培養(yǎng)24-72h。待出現(xiàn)生長特征（培養(yǎng)液混濁、產(chǎn)氣、出現(xiàn)異味）后,按5.1條進行鏡檢。反之，則報告陰性。

4.2.1.2分離培養(yǎng)

　　取4.2.1.1增菌培養(yǎng)物1mL置于滅菌的培養(yǎng)皿中，傾注約15mL45℃的亞硫酸鐵瓊脂。仔細將接種物和培養(yǎng)基充分混勻，待其凝固后，再傾注10mL同樣的培養(yǎng)基作為隔層，于37±1℃厭氧培養(yǎng)24-48h。生成的暗灰色或黑色菌落，按5條加以證實；反之，則報告陰性。

4.2.2結(jié)果計算

4.2.2.1計數(shù)每個稀釋度得到的陽性反應(yīng)管數(shù)。

4.2.2.2利用MPN表，由陽性管數(shù)估算每克（毫升）試樣中亞硫酸鹽還原梭菌最近似值。結(jié)果報告如下：估計亞硫酸鹽還原梭菌數(shù)/g(mL)。

5.證實試驗

5.1形態(tài)觀察

　　取皰肉培養(yǎng)物涂片，鏡檢，作革蘭氏染色，檢查培養(yǎng)物細菌形態(tài)。亞硫酸鹽還原梭菌為革蘭氏陽性桿菌，單個散在，成對、成小鏈狀或并列地聚堆存在。產(chǎn)芽胞時，芽胞呈卵圓形或球形，位于中央、次終端或終端。

5.2過氧化氫酶試驗

　　在潔凈載玻片上滴1滴培養(yǎng)物，再滴加1-2 滴3% 的過氧化氫。

　　出現(xiàn)小氣泡說明有過氧化氫酶活性。

　　亞硫酸鹽還原梭菌不形成過氧化氫酶。

附錄：

A1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液

　　將8.5g氯化鈉和1.0g胰蛋白胨溶解于1000 mL蒸餾水中。調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1。分裝225 mL于250 mL廣口瓶中，121℃高壓滅菌15min。

A2 亞硫酸鐵瓊脂

　　胰蛋白胨 15.0g

　　大豆蛋白胨 5.0g

　　酵母浸膏 5.0g

　　偏重亞硫酸鈉 1.0g

　　檸檬酸鐵銨 1.0g

　　瓊脂 20.0g

　　蒸餾水 1000g

　　將各成分混勻，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.6±0.1，分裝于500 mL錐形瓶中各250 mL，121℃高壓滅菌15 min。一周內(nèi)用完。

A3皰肉培養(yǎng)基

　　牛肉浸液 1000 mL

　　蛋白胨 30.0g

　　酵母浸膏 5.0g

　　磷酸二氫鈉 5.0g

　　葡萄糖 3.0g

　　可溶性淀粉 2.0g

　　碎肉渣 適量

　　取碎肉渣分裝15mm×150mm試管約2-3cm高，將上述液體培養(yǎng)基分裝至每管內(nèi)超過肉渣表面約1 cm。121℃高壓滅菌15 min。

A4 過氧化氫酶試驗

　　挑取培養(yǎng)物一接種環(huán)，置于潔凈載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液（臨用時配制）2mL，于半分鐘內(nèi)觀察發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。