菌株保存要求
菌種作為一項(xiàng)重要的生物資源,對(duì)微生物學(xué)教學(xué)和研究是必不可少的。菌種保存方法因微生物的不同而異。在菌種保存過(guò)程中,必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài),才能在一定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素,故菌種保存方法多依據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)。
菌種保存方法有多種,最理想的為真空冷凍干燥法,具有保存時(shí)間長(zhǎng)、成活率高、變異小等優(yōu)點(diǎn),但操作技術(shù)難度大,花費(fèi)高,需特殊設(shè)備,一般單位不易做到,而一些常規(guī)方法,常因傳代次數(shù)多、易污染、易變異,給保存帶來(lái)諸多不利。
多年來(lái),微生物學(xué)工作者們一直在研究摸索簡(jiǎn)便而行之有效的菌種保存方法,筆者查閱相關(guān)資料并吸取同行工作者們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),總結(jié)了幾種方法簡(jiǎn)便、效果好的保存方法,現(xiàn)介紹如下。
需要4℃冰箱保存的保存法
1、液體石蠟保存法
先將液體石蠟滅菌,然后放于37℃恒溫箱中,使水汽蒸發(fā)掉備用。再將需要保存的菌種在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng),用無(wú)菌吸管吸取已滅菌的液體石蠟,注入已長(zhǎng)好的斜面培養(yǎng)基上,用量以高出斜面頂端1cm 為準(zhǔn)。試管需直立,置4℃或室溫下保存,一般無(wú)芽胞細(xì)菌可保存1年左右。
2、高層半固體瓊脂石蠟保存法
將需保存的菌種經(jīng)平板劃線分離后,挑單個(gè)菌落用接種針?lè)磸?fù)穿刺接種到高層半固體瓊脂培養(yǎng)基中,經(jīng)37℃12小時(shí)培養(yǎng)后取出,用無(wú)菌操作將滅菌的液體石蠟滴加半固體瓊脂菌種管表層約0.5cm高度,存放4℃冰箱,1年轉(zhuǎn)種1次。
3、蒸餾水保存法
取滅菌蒸餾水6-7ml加于試管斜面上,用吸管研磨,洗下菌苔充分混勻,將此菌液分裝于滅菌的螺旋小瓶中,或用膠塞密封,置4℃保存可存活數(shù)年。
需-20℃冰箱冷凍保存的保存法
1、甘油保存法
甘油一生理鹽水保存液的制備:取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份,充分混合后,經(jīng)121.3℃ 30分鐘滅菌備用。
將純化后的菌株根據(jù)菌種不同分別劃線接種于其最適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后,用接種針取典型菌落接種肉湯管37℃培養(yǎng)6-8小時(shí)(鏈球菌和奈瑟氏菌接種血清肉湯管,5-10%CO2環(huán)境下8-10小時(shí)培養(yǎng),真菌直接用接種環(huán)取菌洗入肉湯管,不培養(yǎng))。此為培養(yǎng)液。
將此培養(yǎng)液與保存液以5:2的比例混合分裝于滅菌的微量離心管,置-20℃冰箱保存(鏈球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用時(shí)需37℃水浴中快速解凍。
用上述方法保存一般菌株可存活3年以上,鏈球菌、奈瑟菌可存活12-15個(gè)月,且性狀未發(fā)生變異。此方法采用幼齡肉湯培養(yǎng)物效果好,且適用于鏈球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。
2、低溫保存法
菌種保存液的配制:K2HPO412.6g,檸檬酸鈉0.98g,MgSO4·7H2O 0.18g,KH2PO4 3.6g,甘油88g加蒸餾水至1000ml,103.4KPa滅菌30分鐘,4℃保存?zhèn)溆谩?/font>
將細(xì)菌接種于肉湯培養(yǎng)基中,37℃ 培養(yǎng)16-18小時(shí),或斜面培養(yǎng)物刮取于生理鹽水中,然后加入等體積的菌種保存液,凍存于-70℃或-20℃冰箱中。
此方法也適合甲鏈、肺球、流感桿菌、百日咳桿菌、綠膿桿菌等耐受力低的細(xì)菌。-70℃保存10年以上,-20℃可保存2年以上。
3、細(xì)菌濕種牛奶凍存法
新鮮牛奶或15%奶粉煮沸,冷卻脫脂,分裝小試管,每管1ml,8磅15分鐘滅菌備用。
將純種菌接種于平板,37℃16小時(shí)培養(yǎng),以接種環(huán)刮取菌苔2-3環(huán)于牛奶中混勻,試管用硅膠塞,凍存于普通冰箱冷凍室(-12℃-18℃)。使用時(shí)取出室溫溶解,待部分溶解時(shí)即可取一環(huán)接種平板,并將試管再迅速凍存,這樣可反復(fù)使用3-5次。此法一般菌株可存活48個(gè)月,少數(shù)如奈瑟氏菌、甲鏈、白喉等可存活14-30個(gè)月。
4、甘油原液保存法
將各待保存的菌種純化后用接種環(huán)直接從平板上刮取,置于盛有0.5ml甘油原液的菌種瓶中,-20℃保存,可連續(xù)52個(gè)月存活良好。
此法尤其適合乙鏈、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌種,是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的有效保存方法。
1、 脫纖維羊血
無(wú)菌抽取羊頸靜脈血后,沿瓶壁注入無(wú)菌的帶玻璃的三角燒瓶中,同時(shí)立即同一方向振搖約8-10分鐘,脫去纖維,然后分裝加蓋無(wú)菌小試管中約1.0-1.5ml。
將腦膜炎雙球菌、淋球菌、甲乙型鏈球菌、肺炎雙球菌分別接種于血平板培養(yǎng)基中,前兩者置于5-10% CO2 燭缸內(nèi),經(jīng)35℃16-18小時(shí)培養(yǎng),后三者置37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí),然后無(wú)菌操作取一接種環(huán)菌苔移種于上述新鮮脫纖維羊血試管中,立即置-3O℃冰凍保存二年轉(zhuǎn)種一次。用時(shí)室溫自然冰融即可接種。
2、 紙片法
新華定性濾紙剪成4mm×4mm,1.5ml帶蓋離心管消毒滅菌備用,用消毒小鉗子鉗上濾紙片于平板上刮取待保種的純菌落2-3個(gè)。放于離心管內(nèi)塞蓋再用封口膠布將蓋邊緣封好放于-30℃冰箱保存。保存12個(gè)月后取出菌種解凍后用無(wú)菌鉗取一片放于肉湯管內(nèi)37℃培養(yǎng)12小時(shí)后轉(zhuǎn)種血平板,性狀未變異。
3、 奶粉液菌種保存法
菌種保存液:脫脂奶粉10g,NaCL 10.5g,加雙蒸水100ml,121℃ 5分鐘高壓滅菌后分裝于1ml帶蓋無(wú)菌標(biāo)本杯中(0.5ml)備用。
無(wú)菌操作用4mm×10mm 無(wú)菌濾紙條蘸取新鮮菌少許,放存含奶粉液保存杯中,蓋好,封口膠封口,低溫保存。3年存活率達(dá)99.2% 。
使用時(shí)將標(biāo)本杯取出,不等全部融化,上層有少許融化即用接種環(huán)取一少許接種于血平板分離即可。
菌種是細(xì)菌工作中所不可缺少而又具有傳染性生物學(xué)因子。為了保證工作和安全,對(duì)菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死,還要求其生物學(xué)性狀、生理特性、抗原性等方面不發(fā)生變異,這是保存菌種的重要環(huán)節(jié)。延長(zhǎng)菌種存活期應(yīng)注意:首先,待保存菌種須選擇生長(zhǎng)期幼齡培養(yǎng)物,且制成濃菌液保存,以保證存活率。其次,高層半固體培基最好選擇不含或含糖量低的培基,可減少或避免因代謝產(chǎn)物產(chǎn)生而造成的細(xì)菌死亡。最后,保存溫度的高低可影響存活率,切忌反復(fù)凍融。
以上介紹的幾種方法,取材簡(jiǎn)單,操作容易,已經(jīng)反復(fù)實(shí)踐證明保存時(shí)間長(zhǎng),變異小,適合中小型實(shí)驗(yàn)室使用。