一、脫氣
流動(dòng)相脫氣可以避免HPLC系統(tǒng)出問題,從而順利得到理想的數(shù)據(jù)。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時(shí)要產(chǎn)生很大的力量,由于氣體的壓縮比與液體相比大的多,因而當(dāng)氣泡存在時(shí),你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個(gè)氣泡足夠大,液相泵將不能輸送任何溶劑,而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限,泵將停止工作。有些泵設(shè)計(jì)可以很好地排除氣泡,而也有一些泵設(shè)計(jì)當(dāng)氣泡存在時(shí)將停止運(yùn)轉(zhuǎn)。
當(dāng)一個(gè)氣泡通過輸液泵時(shí),由于系統(tǒng)壓力大,氣泡通常會(huì)溶解在流動(dòng)相溶液中,隨流動(dòng)相通過柱子。但是到達(dá)檢測(cè)器流通池時(shí)系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓,因而氣泡可能在檢測(cè)器流通池中又顯現(xiàn),在色譜圖上會(huì)出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。
紫外/可見光(UV/VIS)檢測(cè)器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過流通池的征兆。此外,對(duì)于利用待測(cè)物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進(jìn)行檢測(cè)的電化學(xué)(EC)檢測(cè)器,對(duì)流動(dòng)相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外,氣泡的存在有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間不重現(xiàn)。
常用的脫氣方法:
1、吹氦脫氣法。
2、加熱回流法。此法的脫氣效果較好。在操作時(shí)要注意冷凝塔的冷卻效率,否則溶劑會(huì)丟失,混合流動(dòng)相的比例會(huì)有變化。
3、抽真空脫氣法。此法可使用真空泵,降壓至0.05-0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會(huì)使混合溶劑組成發(fā)生變化,從而影響到實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性,因此多用于單溶劑體系的簡(jiǎn)單分析。
4、超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動(dòng)相置于超聲波清洗器中,用超聲波震蕩10-20min。此法的脫氣效果最差。
5. 在線脫氣法。現(xiàn)在商品的HPLC儀器,均可配在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡(jiǎn)單,低故障,有效。建議購買儀器時(shí)一定要購買,有的公司是作為選購件,所以與儀器公司談配置時(shí)應(yīng)與公司確認(rèn)。
任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)后都會(huì)在柱子入口端被篩板擋住,最后的結(jié)果是將柱子堵塞,表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此,要采取各種預(yù)防措施,包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計(jì),努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中,從而延長(zhǎng)儀器和色譜柱的使用壽命,并提高數(shù)據(jù)的可靠性。在HPLC系統(tǒng)中,顆粒物的主要來源有三個(gè)途徑:流動(dòng)相、被測(cè)樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。
二、過濾
1、流動(dòng)相
流動(dòng)相通過0.45 μm微孔濾膜過濾對(duì)于從流動(dòng)相中除去所有顆粒物是一個(gè)有效方法。0.2 μm微孔濾膜也可以用,但是它們就這個(gè)應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效,而且它的過濾速度會(huì)更慢,特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時(shí)。建議實(shí)驗(yàn)室在編寫制定他們流動(dòng)相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOPs)時(shí)規(guī)定,可以借鑒國(guó)際上同類實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定,即:
流動(dòng)相制備僅采用HPLC級(jí)液體時(shí)不需要過濾,反之所有流動(dòng)相組成在使用前必須過濾。
在連接儲(chǔ)液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器(常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個(gè)過濾器的規(guī)格為≥10 μm的微孔物質(zhì),所以它不能取代流動(dòng)相過濾步驟,但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲(chǔ)液瓶、輸液管使用的可靠性。2、被測(cè)樣品
液相系統(tǒng)中的第二個(gè)顆粒物來源是被測(cè)樣品。一些實(shí)驗(yàn)室在將他們的樣品放置在自動(dòng)進(jìn)樣器盤(或手動(dòng)進(jìn)樣)以前,所有樣品都先通過一個(gè)0.45 μm針筒式過濾器過濾。這是一個(gè)有效除去被測(cè)樣品中顆粒物的方法。但是這個(gè)過程也有一點(diǎn)需要關(guān)注:你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測(cè)樣品,總會(huì)有或多或少的丟失。
3、儀器系統(tǒng)部件的磨損物
最后,在HPLC系統(tǒng)中顆粒物的另一個(gè)主要來源是輸液泵密封墊和進(jìn)樣閥旋轉(zhuǎn)軸的磨損。關(guān)于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。
第一種建議認(rèn)為,在一般實(shí)驗(yàn)室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個(gè)月到一年,因此建議半年或一年更換這些密封墊,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)基于上述觀點(diǎn)制定定期預(yù)防性維護(hù)計(jì)劃。
該觀點(diǎn)認(rèn)為:與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費(fèi)用相比,更換密封墊的費(fèi)用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網(wǎng),可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物,防止這些顆粒物隨流動(dòng)相流至柱頭。若有這種裝置應(yīng)查閱輸液泵操作手冊(cè),查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。另一種建議則認(rèn)為,原裝密封墊的密封效果最好,更換以后容易引起流動(dòng)相滲漏。所以,只要不漏液就不要輕易更換密封墊。
三、沖洗
使HPLC系統(tǒng)良好運(yùn)行的第三個(gè)要點(diǎn)是保持系統(tǒng)的清潔。你需要關(guān)注流動(dòng)相流經(jīng)該系統(tǒng)的所有地方,對(duì)于這些地方經(jīng)常性的沖洗,將使你的系統(tǒng)保持在“Ready”狀態(tài)。
1、流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶
2、泵
接下來要沖洗的是泵。千萬不要一分析完沖幾分鐘后就停泵,特別是當(dāng)流動(dòng)相中含有難揮發(fā)的緩沖液(如磷酸鹽)時(shí)。如果儀器不是連續(xù)使用,當(dāng)流動(dòng)相蒸發(fā)時(shí),難揮發(fā)物就會(huì)粘在活塞密封墊的表面,難揮發(fā)物將形成固形物沉淀。這是泵密封墊磨損和單向閥滲漏的主要原因之一。所以,無論使用長(zhǎng)短,在停泵以前一定要用非緩沖液流動(dòng)相沖洗泵在半個(gè)小時(shí)以上,要是流動(dòng)相中有難揮發(fā)緩沖鹽則建議沖洗的時(shí)間應(yīng)該更長(zhǎng)些。
3、自動(dòng)進(jìn)樣器
自動(dòng)進(jìn)樣器也要按規(guī)定清洗。現(xiàn)在的儀器多配有自動(dòng)進(jìn)樣器的沖洗液瓶,通常只要注意及時(shí)更換、補(bǔ)充沖洗液即可。自動(dòng)進(jìn)樣器用的洗滌液也要采用與流動(dòng)相相同的方式處理,并根據(jù)溶劑的有效期和規(guī)定,清洗儲(chǔ)液瓶或更換洗滌液,F(xiàn)在的自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置、操作都很簡(jiǎn)單,如果時(shí)間允許(特別是利用夜間運(yùn)行),每次分析完后設(shè)置進(jìn)1、2針純?nèi)軇ㄈ缂状、乙腈),也是一個(gè)好做法。
4、色譜柱
對(duì)柱子的污染是隨使用時(shí)間而增加。通常表現(xiàn)是:運(yùn)行走基線時(shí)在記錄的色譜圖中基線噪音增加,泵壓也增加。解決這個(gè)問題的最有效方法就是在每一批樣品分析結(jié)束后或準(zhǔn)備卸下柱子時(shí)用大量的流動(dòng)相沖洗柱子(例如,甲醇、乙腈和水)。用梯度沖洗效果更好,具體的比例要根據(jù)柱子的說明書和性質(zhì)而定。
5、檢測(cè)器
如果是正常使用,檢測(cè)器將依據(jù)其性質(zhì)并按照說明書規(guī)定進(jìn)行洗。例如UV/VIS檢測(cè)器或FL檢測(cè)器,在對(duì)柱子和系統(tǒng)進(jìn)行沖洗時(shí)也就一同對(duì)檢測(cè)器流通池中污染物進(jìn)行了清洗。但是蒸發(fā)光檢測(cè)器或質(zhì)譜儀則需要按照說明書進(jìn)行定期清洗。這些檢測(cè)器在使用時(shí)會(huì)有難揮發(fā)污染物沉積,如質(zhì)譜儀離子源的噴針、毛細(xì)管、錐孔板、預(yù)四極等部件,因而需要定期清洗。而且對(duì)連有這些檢測(cè)器的系統(tǒng)沖洗時(shí),最好與這些檢測(cè)器斷開,以減少對(duì)檢測(cè)器的污染。
總之,實(shí)驗(yàn)室日常使用的液相色譜儀要是能認(rèn)真做好這三項(xiàng)工作——脫氣、過濾和沖洗,你的儀器可以得到良好的預(yù)防性維護(hù),使用時(shí)就會(huì)感到比較順手。當(dāng)然,在實(shí)際操作時(shí)遇到的問題并沒有這么簡(jiǎn)單,但這三個(gè)良好習(xí)慣將是正確操作、使用HPLC系統(tǒng)的基礎(chǔ)。