將試驗(yàn)菌株和陽(yáng)性及陰性對(duì)照菌株分別接種于0.6mLCAYE培養(yǎng)基內(nèi),37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。加入20000IU/mL的多粘菌素B0.05mL,于37℃ 1h,離心4000r/min 15min,分離上清液,加入0.1%硫柳汞0.05mL,于4℃保存待用。
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)LT和ST
LT檢測(cè)方法(雙抗體夾心法):(1)包被:先在產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌LT和ST酶標(biāo)診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管,加入包被液0.5mL,混勻后全部吸出于3.6mL包被液中混勻,以每孔100μL量加入到40孔聚苯乙烯硬反應(yīng)板中,第一孔留空作對(duì)照,于4℃冰箱濕盒中過(guò)夜。(2)洗板:將板中溶液甩去,用洗滌液I洗3次,甩盡液體,翻轉(zhuǎn)反應(yīng)板,在吸水紙上拍打,去盡孔中殘留液體。(3)封閉:每孔加100μL封閉液,于37℃水浴中1h。(4)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(5)加樣本:每孔分別加各沖試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液100μL,37℃水浴中1h。(6)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(7)加酶標(biāo)抗體:先在酶標(biāo)LT抗體管中加0.5mL稀釋液,混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻,每孔加100μL,37℃水浴中1h。(8)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(9)酶底物反應(yīng):每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μL,室溫下避光作用5~10min,加入終止液50μL。(10)結(jié)果判定:以酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度OD值,待測(cè)標(biāo)本OD值大于陰性對(duì)照3倍以上為陽(yáng)性,目測(cè)顏色為桔黃色或明顯高于陰性對(duì)照為陽(yáng)性。
ST檢測(cè)方法(抗原競(jìng)爭(zhēng)法):(1)包被:先在包被用ST抗原管中加0.5mL包被液,混勻后全部吸出于1.6mL包被液中混勻,以每孔50μL加入于40孔聚苯乙烯軟反應(yīng)板中。加液后輕輕敲板,使液體布滿孔底。第一孔留空作對(duì)照,置4℃冰箱濕盒中過(guò)夜。(2)洗板:用洗滌液I洗3次,操作同上。(3)封閉:每孔,加100μL封閉液,37℃水浴1h。(4)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(5)加樣本及ST單克隆抗體:每孔分別加各試驗(yàn)菌株產(chǎn)毒培養(yǎng)液50μL,稀釋的ST單克隆抗體50μL(先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液,混勻后全部吸出于1.6mL稀釋液中,混勻備用),37℃水浴1h。(6)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(7)加酶標(biāo)記兔抗鼠Ig復(fù)合物:先在酶標(biāo)記兔抗鼠Ig復(fù)合物管中加0.5mL稀釋液,混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻,每孔加100μL,37℃水浴1h。(8)洗板:用洗滌液Ⅱ洗3次,操作同上。(9)酶底物反應(yīng):每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μL,室溫下避光5~10min,再加入終止液50μL。(10)結(jié)果判定:以酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492nm下測(cè)定吸光度(OD)值:
。▓D略)
目測(cè)無(wú)色或明顯淡于陰性對(duì)照為陽(yáng)性。
雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)LT:
將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于Elek氏培養(yǎng)基上。以同樣操作,共做兩份,于36℃培養(yǎng)48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B紙片,于36℃經(jīng)5~6h,使腸毒素滲入瓊脂中,在五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央,挖一個(gè)直徑4mm的圓孔,并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內(nèi)滴加LT抗毒素30μL,用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌株作對(duì)照,于36℃經(jīng)15~20h觀察結(jié)果。在菌斑和抗毒素孔之間出現(xiàn)白色沉淀帶者為陽(yáng)性,無(wú)沉淀帶者為陰性。
乳鼠罐胃試驗(yàn)檢測(cè)ST
將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內(nèi),于36℃培養(yǎng)24h,以3000r/min離心30min,取上清液經(jīng)薄膜濾器過(guò)濾,加熱60℃30min,每1mL濾液內(nèi)加入2%伊文思藍(lán)溶液0.02mL。將此濾液用塑料小管注入1~4日齡的乳鼠胃內(nèi)0.1mL,同時(shí)接種3~4只,禁食3~4h后用三氯甲烷麻醉,取出全部腸管,稱量腸管(包括積液)重量及剩余體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽(yáng)性,0.07~0.09為可疑。