感染懸浮細(xì)胞是使桿病毒系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的普遍方法。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞很容易從10ml擴(kuò)大到100L。一般來(lái)說(shuō)，懸浮的細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)液許多公司有售，比如Life Technologies、Hyclone、Biowhitaker、JRH Biosciences、Expression Systems等，用起來(lái)都不錯(cuò)，盡管由于細(xì)胞株和目的蛋白的不同，效果有所差異。

最好是將目的蛋白和細(xì)胞株用不同的培養(yǎng)液做一個(gè)表達(dá)試驗(yàn)，選出表達(dá)效果最好的一種培養(yǎng)液。在進(jìn)行這個(gè)表達(dá)試驗(yàn)之前要先使你的細(xì)胞株分別適應(yīng)不同的培養(yǎng)液，否則試驗(yàn)結(jié)果不具有代表性。

注意：為了優(yōu)化表達(dá)，你必須了解你的細(xì)胞的生長(zhǎng)參數(shù)；為了方便新手，我將列出一些生長(zhǎng)參數(shù)通常的值。我最喜歡的Sf9細(xì)胞株可以最低以2×105細(xì)胞/ml的濃度分裝，并且恢復(fù)幾乎沒(méi)有滯后期。在對(duì)數(shù)期，20個(gè)小時(shí)細(xì)胞數(shù)目就可以翻倍，濃度最高可以達(dá)到5×106細(xì)胞/ml。下面的實(shí)驗(yàn)步驟將以上面列出的生長(zhǎng)參數(shù)為前提。如果你的細(xì)胞株生長(zhǎng)參數(shù)有所不同，你需要對(duì)實(shí)驗(yàn)步驟做出合適的調(diào)整。

低MOI感染簡(jiǎn)介

低MOI（Multiplicity Of Infection，等于用于感染的病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比值）感染是擴(kuò)增病毒的最好方法。這有兩個(gè)原因。一方面，低MOI感染是最快也是最簡(jiǎn)單的擴(kuò)增病毒數(shù)量的方法；另外，低MOI感染是保存病毒基因的完整性、防止DIP（Defective Interfering Particles，即只包裝入部分基因組的病毒顆粒）生成的最好方法。

還可以用低MOI感染的方法生產(chǎn)蛋白，但是難以控制，并且不適于提高蛋白產(chǎn)量。然而病毒需要量少的確是該法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)這個(gè)優(yōu)點(diǎn)極為有利，只要它們可以可靠的復(fù)制，這因不同的重組病毒而異。對(duì)于小規(guī)模的蛋白生產(chǎn)，我更喜歡用高M(jìn)OI感染。

一般而言，低MOI感染的方法就是先用病毒感染少量細(xì)胞，這些被感染的細(xì)胞復(fù)制出足夠的病毒，去感染培養(yǎng)物中剩余的尚未被感染的細(xì)胞，而這第二批被感染的細(xì)胞就是病毒或者蛋白的主要生產(chǎn)者。

重要的是培養(yǎng)液的量要滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，否則將沒(méi)有足夠的營(yíng)養(yǎng)使細(xì)胞生產(chǎn)病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在細(xì)胞增殖到合適密度并用掉所有營(yíng)養(yǎng)資源之前就被殺死。最理想的是，先確定在沒(méi)有病毒感染時(shí)，細(xì)胞保持正常狀態(tài)所能達(dá)到的最大密度，那么如果病毒的量能夠使細(xì)胞在達(dá)到該密度的1/3~2/3時(shí)停止擴(kuò)增是最理想的。我通常是使用該密度的1/2。

采用這個(gè)方法需要使用足夠的病毒感染細(xì)胞，在24~48小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞停止增長(zhǎng)、所有的細(xì)胞都被感染。因此，以生長(zhǎng)停止作為完全感染的標(biāo)志，培養(yǎng)物在達(dá)到完全感染后可以繼續(xù)生長(zhǎng)大約48小時(shí)。如果以生產(chǎn)蛋白為目的，這個(gè)過(guò)程可能需要更長(zhǎng)。

步驟：

將細(xì)胞以2~4×105細(xì)胞/ml的密度分裝到搖瓶中，達(dá)到搖瓶體積的20~40%。在27±2℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100~130rpm。

第0天

培養(yǎng)細(xì)胞至密度達(dá)到4~8×105細(xì)胞/ml，即已經(jīng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，但是仍處于低濃度。

然后加入少量病毒，病毒量依賴于滴度，但是最好使MOI值介于0.1~0.5。比如，如果你的細(xì)胞濃度為6×105細(xì)胞/ml，而病毒滴度為3×107pfu/ml，那么要使MOI介于0.1~0.5，所加的病毒的體積應(yīng)該是細(xì)胞體積的0.2~1%。

將搖瓶放回27℃搖床，培養(yǎng)24小時(shí)。

感染后第1天

計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。如果病毒的實(shí)際滴度比估計(jì)的高，即MOI值高于0.5，你將看到明顯的細(xì)胞停止生長(zhǎng)和腫脹的跡象；反之，如果MOI值接近0.3或者更低，你將看到細(xì)胞幾乎沒(méi)有受到病毒影響，它們的數(shù)目擴(kuò)增到接近1.2×106細(xì)胞/ml，并且看起來(lái)健康。這個(gè)時(shí)候，被感染的細(xì)胞應(yīng)該正在釋放病毒至培養(yǎng)液中，去感染其它細(xì)胞。

感染后第2天

再次計(jì)數(shù)細(xì)胞并且估計(jì)細(xì)胞的大小。此時(shí)大多數(shù)細(xì)胞應(yīng)該已經(jīng)被感染。細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)該遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于2.4×106細(xì)胞/ml（這是在沒(méi)有病毒感染的情況下細(xì)胞正常生長(zhǎng)應(yīng)該達(dá)到的密度），并且明顯膨脹。

如果細(xì)胞的數(shù)目在感染后第0天和第1天之間沒(méi)有增長(zhǎng)，可能是所有的細(xì)胞都被同時(shí)感染所致，在感染后第二天就可以收獲了。如果不是這種情況，將搖瓶放回27℃搖床，培養(yǎng)24小時(shí)。

感染后第3天

再次計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。如果實(shí)驗(yàn)進(jìn)展與預(yù)料一致，此時(shí)的細(xì)胞數(shù)目與第2天比應(yīng)該沒(méi)有增長(zhǎng)。

如果細(xì)胞數(shù)目在感染后第1天和第2天之間就已經(jīng)停止增長(zhǎng)，這說(shuō)明所有的細(xì)胞在感染后第1天就已經(jīng)被全部感染，此時(shí)可以收獲細(xì)胞，因?yàn)楦腥緯r(shí)間已經(jīng)達(dá)到48小時(shí)，這是一般的情況。

如果細(xì)胞數(shù)目在感染后第1天和第2天之間仍然有一定增長(zhǎng)，并且此時(shí)尚未達(dá)到平臺(tái)期，將搖瓶放回27℃搖床，培養(yǎng)24小時(shí)。

感染后第4天

再次計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。此時(shí)最好所有的細(xì)胞都被徹底感染、膨脹、生長(zhǎng)停止，否則說(shuō)明用于感染的病毒的量不夠，不能在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期前使其停止。此時(shí)應(yīng)該收獲培養(yǎng)物，離心分離細(xì)胞，將培養(yǎng)液避光保存于4℃，或者凍存于-70℃。

通常最好將細(xì)胞沉淀凍存。我喜歡的方法是將細(xì)胞重懸于小量（比如1/4體積）的PBS或者TBS（含有濃度為通常5倍的蛋白酶抑制劑）中，充分重懸后直接用微量移液器加入充滿液氮的干凈Dewar瓶中。滴下的重懸物遇到液氮迅速凍結(jié)形成小球，這些小球可以被分裝到50ml圓錐管中，凍存于Revco冰箱中。當(dāng)需要從細(xì)胞中純化蛋白時(shí)，只需將這些小球逐個(gè)加入到3~5倍體積室溫下不斷攪拌的裂解緩沖液中，它們將很快融化，使緩沖液降至接近0℃。這些小球還可以用鑷子方便的轉(zhuǎn)移到eppendorf管中作小量實(shí)驗(yàn)。