（一）材料及試劑

1．器材

⑴細胞培養(yǎng)板：滅菌的國產(chǎn)96孔或40孔平底聚苯乙烯塑料板或進口96孔細胞培養(yǎng)板。

⑵50μl、100μl、300μl微量加樣器，滅菌的塑料滴頭。

⑶無菌透明膠帶，其密度與塑料板一致。

⑷滅菌的離心管

⑸倒置顯微鏡

2．IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒，標準陽性血清，標準陰性血清，均由指定單位供應(yīng)。

3．細胞培養(yǎng)液

Eagles MEM 45％

0.5％水解乳蛋白－Earle液 45％

犢牛血清 10％

谷氨酰胺 0.03％

青、鏈霉素各200μg/ml

用7％NaHCO3液調(diào)pH6.8～7.0。

（二）操作方法

1．細胞制備 滅菌采取犢牛腎或睪丸，按常規(guī)胰蛋白酶消化法制備牛腎（BK）或睪丸（BT）細胞，置37℃溫箱培養(yǎng)，長成良好單層細胞備用。一般使用次代細胞，但不超過4代。

2．病毒抗原制備 將IBR Baitha—Nu/67弱毒株凍干毒用LE（0.5％水解乳蛋白—Earle液）作10倍稀釋，取長成良好的單層細胞（BK或BT），用Earle’s液洗一次后，按原培養(yǎng)液1／10的量接毒。置37℃溫箱吸附1h，然后加入pH7.1～7.2含青、鏈霉素200g/μgml的LE液至原培養(yǎng)液量，37℃培養(yǎng)，待80%～90％出現(xiàn)典型IBR病變時收獲培養(yǎng)物，凍融2次后，3 000r/min離心10min，其上清即為病毒抗原。測定病毒滴度（TCID）并分裝小瓶，貯于-70℃?zhèn)溆�。半年�?nèi)滴度保持不變。

3．病毒滴度測定 將制備的病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液作10倍遞增稀釋至10-7，每病毒稀釋滴度液接種細胞培養(yǎng)板4孔，每孔50μl，隨后每孔加入細胞懸液（50～60萬細胞／ml）10μl和細胞培養(yǎng)液50μl。設(shè)4孔細胞對照。用透明膠帶封板，置37℃培養(yǎng)。觀察1周，每天記錄細胞病變情況。

細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）的確定按Reed-Muench方法計算，即：

TCID50＝高于50％死亡率的病毒稀釋度的對數(shù) 距離比值×稀釋倍數(shù)（10）的對數(shù)。

4．無菌采集被檢血清，不加任何防腐劑。各種血清均56℃滅能30min。

5．將一瓶已知滴度IBR病毒抗原，用pH7.0～7.2的LE液稀釋成100TCID50／0.05ml，取0.3ml與等量的被檢血清于小試管中，37℃溫箱中和1h。

6．將已中和的被檢血清—病毒混合液加入培養(yǎng)板孔中，每個樣品接種4孔，每孔100ul。再于每一樣品孔中加入100μl細胞懸液，用透明膠帶封板，37℃培養(yǎng)。

7．每次試驗時，均設(shè)立以下對照：

(1) 標準陽性血清 抗原，標準陰性血清 抗原，其操作程序同試驗組。

(2) 被檢血清毒性對照：每份被檢血清樣品接種2孔，每孔50μl，補加細胞培養(yǎng)液50ml，再加細胞懸液100μl。

(3) 細胞對照：每孔加100μl細胞懸液，補加細胞培養(yǎng)液100μl。

(4) 實際使用病毒抗原工作量的測定：將病毒抗原工作溶液（100TCID50／0.05μl）作10倍遞增稀釋至10-3，每個稀釋度接種4孔，每孔50μl，補加細胞培養(yǎng)液50μl，再加細胞懸液100μl。計算本次試驗每0.05ml中TCID50的實際含量。

（三）結(jié)果判定

1．接種后72h判定結(jié)果 當病毒抗原工作液對照、標準陰性血清對照均出現(xiàn)典型細胞病變。標準陽性血清對照無細胞病變，被檢血清對細胞無毒性，細胞對照正常病毒抗原實際含量在30～300TCID50時，方能判定，否則被認為無效。

2．判定標準 未經(jīng)稀釋的被檢血清能使50％或50％以上細胞孔不出現(xiàn)病變者判為陽性。