材料與試劑
1.淋巴細(xì)胞分層液有兩種:
(1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。應(yīng)用時,用蒸餾水配制9%溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,結(jié)構(gòu)式為3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量為60%或75%,每安瓶為20ml裝,常用于人的臟器造影。應(yīng)用時,取60%泛影葡胺原液20ml,加雙蒸餾水15.38ml,即為33.9%泛影葡胺。
1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制:
9%聚蔗糖液 24份
33.9%泛影葡胺液 10份
混合即可。必要時,可測比重。需要備用,可用G5漏斗過濾除菌或114.3℃高壓滅菌15min,4℃保存。一般可保存3個月。
(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液
34%泛影葡胺液 10份
60%右旋糖酐液 12.5份
混合,即為比重1.07~1.09的分層液。分裝于棕色瓶中,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2. 3%的明膠液 稱取明膠3g,溶于0.9%的滅菌生理鹽水,終體積100ml,114.3℃高壓滅菌10min,冷卻后4℃冰箱保存,臨用時37℃預(yù)熱10min。
3.Hank’s液。
操作方法
1.取抗凝血,自然沉降,如是馬屬動物的血液,可直接直立試管架上,讓其自然沉降1h,取上層血漿。如是牛、羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明膠液,混勻后讓其自然沉降,1h后取上層血漿。
2.2 000r/min離心10min,棄上清。
3.沉淀用Hank’s液混懸后,再2 000r/min離心10min。
4.重復(fù)步驟3一次,再用細(xì)胞營養(yǎng)液將白細(xì)胞制成懸液。此液含有整個白細(xì)胞群,包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞?晒┌准(xì)胞計數(shù)用。
5.取2ml細(xì)胞分層液于離心管內(nèi),同時用毛細(xì)吸管吸取約2ml的血漿(自然沉降1h的上層血漿)輕輕加入分層液上,直接加抗凝血也可。
6.以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min。離心后,可見分成多層,最下層是紅細(xì)胞,中間層是分層液,最上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層,即為單個核細(xì)胞層。
7.用毛細(xì)吸管插入到單個核細(xì)胞層并吸取該層,放入另一試管中。
8.以Hank’s液洗滌、離心,最后配制成適當(dāng)?shù)陌准?xì)胞濃度。必要時可計數(shù)。
注意事項
1.血漿或血液加入分層液中時要小心,緩慢不要打亂液層、不要搖動。也可以將分層液加入到血漿的上層。
2.保持淋巴細(xì)胞的活性是非常重要的,所以一般情況下,是現(xiàn)采血,馬上進(jìn)行分離。
3.經(jīng)過分層液分離的淋巴細(xì)胞層,實際上是單個核細(xì)胞層,包括單核細(xì)胞,不包括粒細(xì)胞。欲分離出純的淋巴細(xì)胞,則按下法除去單核細(xì)胞,或收獲單核細(xì)胞。