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mRNA的分離與純化

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

  真核細(xì)胞的mRNA分子最顯著的結(jié)構(gòu)特征是具有5’端帽子結(jié)構(gòu)(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細(xì)胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly(A)尾,通常用Poly(A )表示。這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA的提取,提供了極為方便的選擇性標(biāo)志,寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
mRNA的分離方法較多,其中以寡聚(dT)-纖維素柱層析法最為有效,已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A )的特點,在RNA流經(jīng)寡聚(dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液的作用下,mRNA被特異地結(jié)合在柱上,當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下,mRNA被洗脫,經(jīng)過兩次寡聚(dT)纖維柱后,即可得到較高純度的mRNA。

寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA
一、試劑準(zhǔn)備
1.3M醋酸鈉(pH 5.2)
2.0.1M NaOH
3.1×上樣緩沖液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量,經(jīng)混合后再高壓消毒,冷卻至65℃時,加入經(jīng)65℃溫育(30min)的10%SLS至終濃度為0.1%。
4.洗脫緩沖液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS
5.無水乙醇、70%乙醇
6.DEPC
二、操作步驟
1.將0.5-1.0g寡聚(dT)-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈,將寡聚(dT)-纖維素裝柱0.5-1ml,用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。
3.使用1×上樣緩沖液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.將RNA溶解于DEPC H2O中,在65℃中溫育10min左右,冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液,混勻后上柱,立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后,再用1×上樣緩沖液洗柱,繼續(xù)收集流出液。
5.將所有流出液于65℃加熱5min,冷卻至室溫后再次上柱,收集流出液。
6.用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱,每管1ml分部收集,OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高,其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。
7.用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A )RNA,分部收集,每部分為1/3-1/2柱體積。
8.OD260測定Poly(A )RNA分布,合并含Poly(A )RNA的收集管,加入1/10體積3M NaAc(pH5.2)、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇,混勻,-20℃放置30min。
9.4℃離心,10000g×15min,小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意:此時Poly(A )RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心,10000g×5min,棄上清,室溫晾干。
10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事項
1.整個實驗過程必須防止Rnase的污染。
2.步驟(4)中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個,一個是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu),尤其是mRNA Poly(A )尾處的二級結(jié)構(gòu),使Poly(A )尾充分暴露,從而提高Poly(A )RNA的回收率;另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合,否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
3.十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降,會阻礙柱內(nèi)液體流動,若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纖維素柱可在4℃貯存,反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。
5.一般而言,107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A )RNA,約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%。

 
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