甲醇酵母基因表達系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質生產系統(tǒng)。甲醇酵母是可利用甲醇作為唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種，其中Pichia Pastoris作為基因表達系統(tǒng)使用得最多、最廣泛［1］。與以往的基因表達系統(tǒng)相比，它具有無可匹敵的高表達特性，已被認為是最具有發(fā)展前景的生產蛋白質的工具之一。
1. 外源蛋白質的基因在甲醇酵母中的高效表達
目前已有多種蛋白質的基因在該表達系統(tǒng)中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制劑、受體、單鏈抗體等(表1)。盡管各種外源蛋白質產生的水平不一，但各種蛋白質在甲醇酵母中的產生水平均為在細菌、昆蟲或哺乳動物等表達系統(tǒng)中產量的10～100倍［2］。如表皮生長因子(EGF)在釀酒酵母中的產量為7.4mg/L，而在甲醇酵母中為450mg/L，提高了60倍［3］。椐報道，外源蛋白質在甲醇酵母中的產量最高可達12g/L［9］。
表1 外源蛋白質在甲醇酵母中的高效產生
| 外源蛋白質 | 產生量(g/L) | 文獻 |
| 轉化酶 | 2.3 | ［4］ |
| D-丙氨酸羧肽酶 | 0.8 | ［5］ |
| α-淀粉酶 | 2.5 | ［6］ |
| Kunitz蛋白酶抑制劑(AbPP) | 1.0 | ［7］ |
| 瞬時抗凝蛋白(TAP) | 1.7 | ［8］ |
| 破傷風毒素片段C | 12.0 | ［9］ |
| 百日咳抗原P69 | 3.0 | ［10］ |
| 人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 | 1.3 | ［11］ |
| 腫瘤壞死因子(TNF) | 10.0 | ［12］ |
| 人轉鐵蛋白N端 | 4.0 | ［13］ |
2. 實現外源蛋白質高效產生的關鍵因素
2.1 表達載體 首先，甲醇酵母中沒有穩(wěn)定的質粒，所以其表達載體采用整合型質粒。利用醇氧化酶(甲醇代謝的關鍵酶)基因-1(AOX1)的啟動子(PAOX1)和轉錄終止子(3′AOX1)構建成整合型表達載體。PAOX1是一個極強的啟動子，醇氧化酶的產量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白質的30%［2］，所以能使外源蛋白質在它的控制下高效產生。其次，在載體中加入釀酒酵母的分泌信號和前導肽序列(α因子)構建分泌型載體，一方面可以減輕宿主細胞的代謝負荷，另一方面可以減少宿主細胞蛋白水解酶對外源蛋白質的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均為此類載體。此外，使多拷貝目的基因整合入甲醇酵母染色體，形成多個表達單元，產生高產的菌株，此類載體有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。
2.2 受體菌 在以葡萄糖或甘油為碳源的培養(yǎng)基上生長時，甲醇酵母中AOX1基因的表達受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時，誘導基因表達，使外源蛋白質的產量更高。甲醇酵母適合高密度連續(xù)培養(yǎng)的條件，細胞干重達100g/L以上，蛋白質產量極高［14］。受體菌采用蛋白水解酶缺陷型，從而大大降低產物的降解。常用的甲醇酵母受體菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。?
3. 應用前景
經過近幾年的發(fā)展完善，甲醇酵母表達系統(tǒng)已日趨成熟，應用也日趨廣泛。國內已有多篇在甲醇酵母中生產外源蛋白質成功的報道(表2)。美國Invitrogen公司也已開發(fā)出多種新型的甲醇酵母表達系統(tǒng)試劑盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表達系統(tǒng)克隆一個外源基因已十分方便。相信隨著對甲醇酵母研究的進一步深入，它在生產外源蛋白質方面將日益展示出誘人的前景。
表2 國內利用甲醇酵母產生的外源蛋白質
| 外源蛋白質 | 產生量(g/L) | 文獻 |
| 人胰島素 | 0.25 | ［15］ |
| 人胰島素原 | 0.3 | ［16］ |
| 人p53蛋白 | 0.2 | ［17］ |
| 辣根過氧化物酶 | 4～6 | ［18］ |
| 人基質金屬蛋白酶-9 | 0.01 | ［19］ |
［1］李黃金等. 《生物工程學報》，1998，14(4)：337
［2］戴秀玉. 《微生物學報》，1997，37(6)：483--485
［3］彭毅等. 《生物技術通報》，2000，(1)：38
［4］Tschopp JF. Bio/Technology，1987，5：1305-1308
［5］Despreaux CW et al. Gene，1993，131：35--41
［6］Paifer E et al. Yeast，1994，10：1415--1419
［7］Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun，1992，186：1138--1145
［8］Laroche Y et al. Bio/Technology，1994，12：1119--1124
［9］Clare JJ et al. Bio/Technology，1991，9：455--460
［10］Romanos MA et al. Vaccine，1991，9：901--906
［11］Scorer CA et al. Gene，1993，136：111--119
［12］Sreekrishna K et al. Biochemistry，1989，28：4117--4125
［13］Cregg JM et al. Bio/Technology，1993，11：905--910
［14］柴清等.《生命的化學》，1997，17(4)：36
［15］王燕等.《生物化學與生物物理學報》，1999，15(3)：587--589
［16］郭永志等.《生物工程進展》，1999，19(6)：64
［17］邱榮德等.《生物工程學報》，1999，15(4)：477
［18］蔣太交等.《生物化學與生物物理進展》，1999，26(6)：584
［19］顏紅春等.《中國生物化學與分子生物學學報》，2000，16(2)：194
