合成基因
目前有許多基因和蛋白質(zhì)的核苷酸和氨基酸序列已得到闡明,人們已經(jīng)可以根據(jù)需要合成出具有實(shí)際應(yīng)用和研究價(jià)值的多肽和蛋白質(zhì)基因。已報(bào)道的合成基因有人生長激素、干擾素、胰島素、表皮生長因子、白細(xì)胞介素II、集落刺激因子等,絕大多數(shù)已在原核和真核系統(tǒng)中獲得表達(dá)。
合成基因的方式
1 全基因合成:
分子較小而又不易得到的基因采用該方式。
將雙鏈基因分成若干寡核苷酸單鏈片段(尤其待合成基因在100個(gè)核苷酸以上時(shí)),每個(gè)片段長度控制在40~60個(gè)堿基,并使每對相鄰互補(bǔ)的片段之間有4~6個(gè)堿基交叉重疊。
在體外將除基因兩端末端外的所有片段磷酸化;旌贤嘶鸷蠹尤隓NA連接酶,即可得到較大的基因片段。
2 酶促合成:
又稱基因的半合成。全基因,特別是較大的基因的全部化學(xué)合成成本昂貴,使用半合成的方法可以降低成本,從而利于普及使用。
首先合成末端之間有10~14個(gè)互補(bǔ)堿基的寡核苷酸片段,退火后以重疊區(qū)作為引物,在4種dNTP存在的條件下,通過DNA聚合酶I大片段(Klenow酶)或反轉(zhuǎn)錄酶的作用,獲得兩條完整的互補(bǔ)雙鏈。
合成探針
人工合成的具有特定順序的寡聚DNA片段,已應(yīng)用于篩選和鑒定重組質(zhì);λ噬菌體。實(shí)驗(yàn)證明用合成的寡核苷酸片段,即使只有1對堿基錯(cuò)配采用嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交也能與完全互補(bǔ)的雙鏈相區(qū)別。
合成引物
1.合成PCR引物進(jìn)行基因擴(kuò)增
PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。該法操作簡便,可在短時(shí)間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬特異DNA序列拷貝。PCR技術(shù)的特異性取決于所用引物和模板DNA結(jié)合的特異性。
2.序列測定用引物
DNA序列測定是分子生物學(xué)中最重要和最精細(xì)的研究技術(shù),其中最常使用的是末端終止法,即是一種依賴于特異DNA引物的序列測定方法。
3.合成導(dǎo)入突變用的引物:
利用寡核苷酸引導(dǎo)的突變,可在目的DNA序列的任何部分產(chǎn)生點(diǎn)突變、插入和缺失,從而使得基因編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生改變。
合成連接子和接頭
在DNA重組中常需要將外源DNA片段插入某些載體DNA中。如果載體或外源DNA上沒有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),為提高插入效率或?qū)崿F(xiàn)定向克隆,可采用合成連接子(linker)和接頭(adaptor)的方法。
合成基因在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
許多疾病,如遺傳性疾病、腫瘤、心血管疾病等可在基因結(jié)構(gòu)上找到某些變化,如基因的缺失、突變、轉(zhuǎn)位,以此作為證據(jù)可對這些疾病作同相應(yīng)的判斷。
目前,合成DNA探針已廣應(yīng)用于臨床,成為一種有效的診斷手段。
1 用于遺傳病的診斷
過去僅有少數(shù)遺傳性疾病可以憑借蛋白質(zhì)和酶學(xué)方面的異常作出判斷,隨著分子生物的發(fā)展,對遺傳病的診斷有了巨大的進(jìn)步,出現(xiàn)了基因診斷法。
例如鐮刀狀細(xì)胞貧血癥即是由于A→T突變造成β-珠蛋白第六位谷氨酸變?yōu)槔i氨酸,從而造成珠蛋白結(jié)構(gòu)異常,并引起紅細(xì)胞形態(tài)及對氧的親合力發(fā)生改變。
2 用于傳染病的診斷
臨床上對傳染性疾病的傳統(tǒng)診斷程序常常是檢測病原體及其抗體,需時(shí)較長,達(dá)不到早期診斷的目的。
合成探針在傳染病特別是由病毒感染性所致的傳染病檢測中,已得到廣泛應(yīng)用,尤其是結(jié)合PCR方法使診斷的靈敏度可進(jìn)一步提高,目前國內(nèi)已制出檢測乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、輪狀病毒和皰疹疾病等多種基因探針診斷試劑盒。