如何設(shè)計有效的siRNA一直是當(dāng)前RNAi研究的熱點話題.基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇。目的序列可以隨機選擇也可以通過在目的基因的不同區(qū)域上測試不同的序列以決定何種序列是最有效的。以下所述幾條對于siRNA設(shè)計的成功極為重要。

1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。正義鏈和反義鏈都采用這19個堿基(不包括AA重復(fù))來設(shè)計。

2.避免在起始密碼子或無義區(qū)域附近選擇目的序列。

3.SiRNA序列的GC含量應(yīng)為30%-50%左右。

4. Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。

5. 將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性。

6.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST

7.選出合適的目標(biāo)序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

8.負對照:一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負對照，作為負對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。

如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。