亚洲第一a在线网站_日韩欧美国产专区_久久国产亚洲女同精品_亚洲国产小电影在线观看高清

VIP標(biāo)識(shí) 上網(wǎng)做生意,首選VIP會(huì)員| 設(shè)為首頁(yè)| 加入桌面| | 手機(jī)版| RSS訂閱
食品伙伴網(wǎng)服務(wù)號(hào)
 

酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)疑難解答

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

問(wèn):如果誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞是有毒的,該怎么辦?

答:在有些情況下,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌珠可以在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得很好。重懸克隆于1ml的SD/–Trp,接著將重懸液平鋪于5 個(gè)100-mm的SD/–Trp平板。在30℃下溫浴,直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆,并收集到一管中。接著就使用這個(gè)細(xì)胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應(yīng)。

問(wèn):我的誘餌蛋白能直接激活報(bào)告基因的表達(dá),該如何處理?

答:該蛋白很可能有轉(zhuǎn)錄激活域,是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。這可以通過(guò)基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域,然后重新檢測(cè)其是否自激活。但重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

問(wèn):轉(zhuǎn)化效率太低,怎么辦?
答:1. 檢測(cè)一下DNA的純度,如果可以的話,重新用乙醇純化。
2. DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。
3. 不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基,重新配制培養(yǎng)基,并做對(duì)照轉(zhuǎn)化。
4. 檢測(cè)pGBT9對(duì)照載體的轉(zhuǎn)化效率,放置于SD/–Trp平板上,轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該在1 x 105 colonies/mg DNA以上。

問(wèn):雜交效率不高,該如何處理?
答:在雜交中,預(yù)轉(zhuǎn)化的誘餌細(xì)胞的數(shù)量可能不夠。當(dāng)你對(duì)誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)夜時(shí),應(yīng)挑選大的,新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)離心和重懸后,使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。密度應(yīng)該在1 x 109/ml。
一個(gè)甚至兩個(gè)融合蛋白對(duì)酵母細(xì)胞有毒。你可以通過(guò)重組方法來(lái)減輕毒性,同時(shí)又能保證蛋白的相互作用;蛘呤褂帽磉_(dá)水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或?yàn)V膜上進(jìn)行雜交。但同時(shí)必須作雜交對(duì)照實(shí)驗(yàn)。


 
[ 網(wǎng)刊訂閱 ]  [ 食品專(zhuān)題搜索 ]  [ ]  [ 告訴好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 關(guān)閉窗口 ] [ 返回頂部 ]

 

 
推薦圖文
推薦食品專(zhuān)題
點(diǎn)擊排行
 
 
Processed in 0.018 second(s), 17 queries, Memory 0.88 M