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cDNA探針

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02

  cDNA(complementary DNA)是指互補于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經一種稱為逆轉錄酶(reverse transcriptase)的DNA聚合酶催化產生的,這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板,根據(jù)堿基配對原則,按照RNA的核苷酸順序合成DNA(其中U與A配對)。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反,故稱反向轉錄或逆轉錄。攜帶逆轉錄酶的病毒侵入宿主細胞后,病毒RNA在逆轉錄酶的催化下轉化成雙鏈cDNA,并進而整合人宿主細胞染色體DNA分子,隨宿主細胞DNA復制同時復制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止狀態(tài)下,可被復制多代,但不被表達,故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化,則該病毒大量復制,如其帶有癌基因,還可能誘發(fā)細胞癌變,后來發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中,而且哺乳動物的胚胎細胞和正在分裂的淋巴細胞也含有逆轉錄酶。逆轉錄酶的作用是以dNTP為底物,RNA為模板,tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物,在Trna3’-OH末端上,5’-3’方向,合成與RNA互補的DNA單鏈,稱為互補DNA(cDNA),單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉錄酶的RNase H活性作用下,將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端,逆轉錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈,至此,完成逆轉錄全過程,合成雙鏈cDNA。

  逆轉錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學技術,廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉錄病毒中提取的逆轉錄酶已商品化,最常用的有AMV逆轉錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸(oligo(dT))用作引物,在逆轉錄酶催化下合成互補于mRNA的cRNA鏈,然后再用RNase H將mRNA消化掉,再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈,即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉錄過程。

  所得到的雙鏈cDNA分子經S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(linker),再經特定的限制酶消化產生粘性末端,即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA,如λgt,EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉化子的文庫,再經前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術獲得的DNA探針不含有內含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。


 
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