1.光敏生物素標記核酸 目前使用的光標生物素試劑有兩種:光生物素(乙酸鹽)和補骨脂素生物素。它們都是由一個光敏基團、一個連接臂和一個生物素基團組成。光生物素的餉艋?攀?N3,它在光作用下可與核酸中的堿基結合。補骨脂素生物素中的光敏基團補骨脂素在光照(320~400μm)下,可與單鏈或雙鏈核酸發(fā)生反應,反應主要在T上,C上也有一定程度的反應。光敏生物素的連接臂含6~12個碳原子,用以減少探針雜交時的空間位阻。光敏生物素標記核酸,方法簡單,靈敏度也可達到pg水平,可用于外源基因的檢測。最近出現了一種新的光敏活性DNA生物素試劑,即生物素-聚乙二醇-當歸素(BPA)。BPA的DNA結合部分是一個活性糖香豆素衍生物,在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結合。BPA反應物與DNA結合比光敏生物素更特異,在可見光下它不與核酸反應,這個特性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸,而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。
2.酶促生物素標記核酸 以生物素化的脫氧核苷三磷酸(Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、Bio-11-dCTP)等代替相應32P標記的脫氧核苷三磷酸,經DNA聚合酶作用摻入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP,Bio- dCTP代替dCTP。Bio –11-dUTP的11是指生物素基團與脫氧核苷酸之間連接臂的碳鏈長度。常用的酶促生物素標記DNA的方法有缺口平移法和隨機引物延伸法。
3.寡核苷酸的生物素末端標記 有5’-磷酸的化學標記法和3’-OH的酶促標記法。前者將寡核苷酸的5’-磷酸接上一個乙二胺,然后用琥珀酰亞胺生物素,將生物素基團連接在磷酸酰胺基上。后者是用末端轉移將Bio-11–dUTP加于其3’-OH端(脫去一個焦磷酸)。
4.酶標DNA 標記試劑是辣根過氧化酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)。通過對苯醌(PBQ)與聚乙烯亞胺(PEI)連接而成(HRP-PBQ-PEI ),此試劑在戊二醛的作用下與變性的DNA結合,使HRP與DNA連接在一起,組成HRP標記的DNA探針。
5.酶標寡核苷酸 包括核苷酸5’末端標記HRP法和內部標記AP法。前者是在HRP中產生一個-HS反應基團,在寡核苷酸合成終了加在5’端,帶一個C6的-HS基,與活化的HRP反應生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸過程中將一個5’帶連接臂及CF3基團的尿苷3’亞磷酰亞胺合成在寡核苷酸鏈中,合成后此活化的寡核苷酸與AP反應即得到AP標記的寡核苷酸。
6.DNA半抗原標記 其原理與Bio-11-dTUP相同,只是用毛地黃甙代替生物素形成Dig –11- dUTP,酶促摻入DNA分子。用抗毛地黃甙抗體檢測標記在DNA上的半抗原分子Digoxigenin