1.感受態(tài)的制備
。1)接種單菌落于2ml LB培養(yǎng)液中, 37℃過夜。
(2)取0.25ml過夜菌入25ml LB培養(yǎng)液中,37℃振搖4~6h至A590=0.4~0.6。
(3)倒入50ml管內(nèi),水浴10min,以2500~3000rpm離心5min,棄上清。
。4)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl25ml懸浮菌體,冰浴20min,同上離心棄上清。
。5)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl21.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中,每管200μl,冰浴1~2h。
2.重組DNA的轉(zhuǎn)化
(1)將3只Eppendorf管按下列轉(zhuǎn)化項(xiàng)目作好標(biāo)記:
。2)冰浴30min至1h。中間搖動(dòng)3次,以防受體菌沉底。
。3)42℃90s。
。4)37℃水浴5min。
。5)加入無相應(yīng)抗生素的Lb 200μl,混勻后,37℃水浴30~60min。
。6)分別取3組反應(yīng)物各50μl在含相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布,室溫下干燥,然后倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。