最常用的將克隆重組的DNA片段導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法是用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的DNA可能是通過吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),然后進(jìn)行細(xì)胞核。
。1)配制下列溶液
、2×HEPES-緩沖鹽溶液(HBS)
、2mol/L CaCl2
、0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌,分裝貯存于4℃。
、蹹NA:將DNA(約20μg/106細(xì)胞)溶于0.1×TE(pH8.0),使用濃度為40μg/ml。為使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高,質(zhì)粒DNA應(yīng)用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少,應(yīng)加入載體DNA將DNA濃度調(diào)至40μg/ml。實(shí)驗(yàn)室制備的真核載體DNA轉(zhuǎn)染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應(yīng)通過乙醇沉淀或氯仿抽提進(jìn)行滅菌。
(2)轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶進(jìn)行消化以獲得對數(shù)生長期的細(xì)胞,以1~2×105細(xì)胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃、5%~7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20~24h。
。3)每轉(zhuǎn)染一個60mm培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞,須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物:取步驟一所制備的DNA[40μg/ml,溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中,緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣(溫和混合30s左右)。于室溫育20~30min,其間將形成細(xì)小沉淀。溫育結(jié)束時,用吸管將混合液吹打一次,使沉淀物懸浮。
通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中,逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣(250mmol/L)的DNA。按照前述方法溫育之。
如果需要轉(zhuǎn)染更為大量的細(xì)胞,上述兩種反應(yīng)混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番,則須使用更大的塑料管,一般在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上,可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養(yǎng)液中,而在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上,一般將1ml沉淀物加入10ml培養(yǎng)液中。
已經(jīng)發(fā)表的方案中,混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認(rèn)為除了溫和振搖之外,其它措施均無濟(jì)于事,并建議用電動移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規(guī)勸在加入DNA溶液時連續(xù)而緩慢地混勻,然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物,以致降低轉(zhuǎn)化效率。實(shí)際上,除了混合的速度之外,還有其它若干因素包括DNA的濃度和大。ㄗ尭叻肿恿緿NA從細(xì)針頭中通過,可將之剪切變。、緩沖液的精確pH(有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液,逐批試驗(yàn)沉淀物的質(zhì)量及轉(zhuǎn)染效率)。如果必須使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高,就要花時間針對特定的系統(tǒng)優(yōu)化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗(yàn)的試劑,只需依照前面方法進(jìn)行配制和貯存,即可在長期內(nèi)獲得可重復(fù)的結(jié)果。
(4)將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞單層上的培養(yǎng)液中[在60mm培養(yǎng)皿中,可將0.5ml懸液加入5ml培養(yǎng)液中],輕輕左右晃動一下培養(yǎng)皿使培養(yǎng)液得以混合,此時可見培養(yǎng)液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養(yǎng)液,直接把沉淀物加到細(xì)胞上,將細(xì)胞置于室溫溫育15min,然后再將培養(yǎng)液加回到培養(yǎng)皿中,此時細(xì)胞上有許多細(xì)小顆粒。采用以上兩種方法,都要在37℃、5%~7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)長達(dá)24h[時間的長短取決于后續(xù)處理步驟的不同,見步驟(5)]。
。5)然后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞可依以下任一種方法處理:
、偃绻贿M(jìn)行其它處理(如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理,見后),可在細(xì)胞培養(yǎng)16~24h后,吸出培養(yǎng)液和沉淀物,用PBS將單層細(xì)胞再洗一次。然后按下述③d操作。
②在許多情況下,同時用氯喹處理細(xì)胞,可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時間不能超越細(xì)胞對其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定適于所用特定型別細(xì)胞的最佳氯喹濃度。但對于大部分型別的細(xì)胞,用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3~5h,都可取得良好效果?稍诹姿徕}-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之前或之后(見步驟(4)介紹的其它方法),直接將氯喹二磷酸貯存液(過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中,100mmol/L)稀釋(1:100)于培養(yǎng)液中。在氯喹處理過程中,細(xì)胞呈現(xiàn)泡狀是正常的。經(jīng)用DNA和氯喹處理3~5h后,棄去培養(yǎng)液和沉淀,用PBS洗,然后按下述d操作。
、塾酶视投虝禾幚砑(xì)胞,同樣可提高轉(zhuǎn)化效率或?qū)隓NA的瞬時表達(dá)水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進(jìn)行。由于不同細(xì)胞對甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊,因此每種型別的細(xì)胞都必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)決定最佳處理時間(從30s至3min)。耐受甘油的細(xì)胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物(含或不含氯喹)的生長液3~5h后進(jìn)行休克。
a. 吸出生長液,用PBS將單層細(xì)胞洗1次;
b.在單層細(xì)胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油,在37℃培養(yǎng)0.5~3min;
c.吸出甘油,用PBS將單層細(xì)胞洗1次;
d.加入5ml預(yù)加溫的完全生長液,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24~60h后,檢測DNA的瞬時表達(dá)或?qū)⒓?xì)胞重新種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中,分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
、軜I(yè)以表明,丁酸鈉也可以在猴源和人源細(xì)胞中增強(qiáng)帶SV40早期啟動子/增強(qiáng)子的重組質(zhì)粒的表達(dá)?芍苯釉谏L液中加入有關(guān)試劑,也可以使經(jīng)過甘油休克的細(xì)胞接受丁酸鈉處理。須視細(xì)胞型別的不同,采用不同濃度的丁酸鈉(500mmol/L貯存液,在化學(xué)通風(fēng)櫥中用NaOH中和丁酸制備而成),例如:
CV-1 10mmol/L
NIH-3T3 7mmol/L
HelaS3 5mmol/L
CHO 2mmol/L
不加完全生長液,然后重復(fù)步驟d。
。6)轉(zhuǎn)移基因表達(dá)和細(xì)胞集落形成
、偎矔r表達(dá):在轉(zhuǎn)染后48~60h收獲細(xì)胞,進(jìn)行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質(zhì)可以用放射免疫測定Western印跡,體內(nèi)代謝標(biāo)記-免疫沉淀或者細(xì)胞提取液中酶活性的測定等方法來進(jìn)行分析,如果測定中有重復(fù)品或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞要經(jīng)過多種不同條件或在一段時間歷程以內(nèi)取不同時間進(jìn)行處理,就要避免皿與培養(yǎng)皿之間轉(zhuǎn)染效率的偏差。在這些情況下,最好轉(zhuǎn)染大片的單層細(xì)胞(90mm培養(yǎng)皿),培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化,再分接到若干較小的培養(yǎng)皿上。
、诜(wěn)定轉(zhuǎn)化:在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18~24h,使所轉(zhuǎn)移基因得到表達(dá)之后,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基在2~3周內(nèi)每2~4d須更換1次,以便除去死細(xì)胞殘骸并使抗性細(xì)胞集落得以生長。
可以克隆單個細(xì)胞集落,增殖后進(jìn)行測定?梢杂帽A(yù)冷的甲醇將仍保留在培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞固定15min,再于室溫用10%Giemsa染色15min,最后用自來水沖洗,這樣即可得到細(xì)胞集落數(shù)的永久記錄。Giemsa染液可用PBS或水現(xiàn)用現(xiàn)配,并用Whatman 1號濾紙過濾。
重新接種細(xì)胞以便取得分隔良好的細(xì)胞集落所要求稀釋倍數(shù),主要由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率來決定。這一效率可以相差若干個數(shù)量級,它起決于:a.受體細(xì)胞的型別(即使同一細(xì)胞系,克隆不同或傳代數(shù)不同,也表現(xiàn)出顯著差異);b.導(dǎo)入基因的特性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號強(qiáng)弱;c.轉(zhuǎn)染中所用供體DNA的量。