對分散在若干個瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于4℃直至得到篩選結(jié)果。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)塹奶秸朐詠弧?BR> 3.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時。
(5) 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒炓髧?yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標(biāo)記�？蓮牡灼先∠峦该骷�,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。
1. 將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養(yǎng)至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個以上的不對稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。
(5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。
(6) 裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜, 再重復(fù)一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜,轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2小時,固定DNA。
(6) 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)塹奶秸朐詠弧?BR> 3.雜交
(1) 盛有2×SSC的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5分鐘。
(2) 將濾膜轉(zhuǎn)到200ml預(yù)洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺上。于50℃處理30分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應(yīng)緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預(yù)洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預(yù)雜交1-2小時。
(5) 將32 P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng)蓋嚴(yán)，以防液體蒸發(fā)。
(6) 雜交結(jié)束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時應(yīng)避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC和0.1% SDS溶液洗膜兩次,每次1-1.5小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或?qū)嶒炓髧?yán)格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。
(8) 把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標(biāo)記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應(yīng)。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16小時。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標(biāo)記�？蓮牡灼先∠峦该骷�,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。
