1．總RNA的提�。∟orthern 雜交）
2．第一鏈合成：
(1)總RNA樣品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O補(bǔ)至5μl。將管標(biāo)號(hào)為1A,2A,PC A等。PC為陽(yáng)性對(duì)照。
(2)混勻后稍離心。
(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍離心。
(4）準(zhǔn)備dNTP mix (以5管為例 )
每管 5管
5×第一鏈緩沖液 2μl 10μl
dNTPmix（各5mM） 2μl 10μl
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200u/μl） 1μl 5μl
5μl 25μl
(5）每管加入5μl，混勻后稍離心。
(6）42℃孵育1hr。
(7）75℃ 10min終止反應(yīng)后置冰上，稍離心。
(8)將2μl反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)至新管中（新管標(biāo)號(hào)為1B,2B,PC B等）。
(9) 將78μl ddH2O分別加入B管中,混勻。
(10)將72μl ddH2O分別加入A管中，混勻。
(11）將所有cDNA稀釋液 -20℃保存待用。
3．dd-PCR: 以 引物P1,T9為例說(shuō)明
（0.5ml PCR管,1代表對(duì)照組,2代表實(shí)驗(yàn)組）
管號(hào) cDNA樣品 引物
(1) 1A P1,T9
(2) 1B P1,T9
(3) 2A P1,T9
(4) 2B P1,T9
(5) H2O P1,T9
(6) RNA1 P1,T9
(7) RNA2 P1,T9
以下為陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系
(8) PC 1A P10,T8
(9) PC 1B P10,T8
(10) PC 2A P10,T8
(11) PC 2B P10,T8
(12) H2O P10,T8
(13) PC RNA1 P10,T8
(14) PC RNA2 P10,T8
在PCR 管中加入:
① cDNA樣品 1μl
P引物 1μl
T 引物 1μl
② 準(zhǔn)備其它 PCR試劑的混合液: (在另一管中加入)
成分 每管(μl) 所需管數(shù)( n=14)
10×buffer 2.0 2n
ddH2O 14.0 14n
dNTPmix 0.2 0.2n
α-32P dATP 0.4 0.4n
Taq酶 0.4 0.4n
終體積 17.0 17 n
混勻后稍離心。
③ 將17μlPCR混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20μl。
④ 開(kāi)始PCR擴(kuò)增。
⑤ PCR循環(huán)參數(shù)：
在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 擴(kuò)增儀上執(zhí)行以下程序：
94℃ 5min
1 cycles 40℃ 5min
68℃ 5min
94℃ 30sec
2 cycles 40℃ 30sec
68℃ 5min
94℃ 20sec
23 cycles 40℃ 30sec
68℃ 2min
1 cycles 68℃ 7 min。
⑥ 反應(yīng)結(jié)束后置-20℃保存?zhèn)溆谩?
4．電泳和放射自顯影
(1）配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，灌注測(cè)序板。
(2）預(yù)電泳30min。
(3）每個(gè)dd-PCR反應(yīng)取出5μl于一新微量離心管中，加5μl loading
buffer，混勻，離心，置94℃變性2min。立即置冰浴。
(4)停止預(yù)電泳，沖洗加樣孔。
(5)加樣2μl。70W電泳2.75hr至二甲苯青到達(dá)膠的底部。
(6）下膠：（同測(cè)序膠）
(7）干膠：在膠表面覆上保鮮膜，80℃干膠30min。
(8)X光片-70℃曝光過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間(根據(jù)射線強(qiáng)度而定)。
圖2-6顯示了dd-PCR放射自顯影的X光片
5．差異條帶回收再擴(kuò)增
(1）X光片經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片燈上比較尋找差異條帶。
(1) 用一次性手術(shù)刀片在膠上切割差異條帶，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，離心取上清為模板。
(3) 以原引物擴(kuò)增：
回收DNA 7 μl
10×PCR buffer 5 μl
5mM dNTPmix 0.5 μl
引物P 2.5 μl
引物T 2.5 μl
Taq酶 2 μl
加ddH2O至總體積為50μl
(4) 執(zhí)行PCR程序:
93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循環(huán)；68℃5min。
(5) 取PCR產(chǎn)物10μl 2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
(6) PCR產(chǎn)物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。
6．以PCR產(chǎn)物為探針，標(biāo)記后進(jìn)行Northern雜交，證實(shí)基因的真實(shí)性。
7．PCR產(chǎn)物的TA克隆。
8．DNA序列測(cè)定。
9．檢索分析。
