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IgM分子由5個(gè)亞基組成，亞基之間有二硫鍵（S-S）鏈接，二硫鍵同時(shí)還連接著亞基中重鏈和輕鏈。亞基之間的二硫鍵能被硫醇試劑裂解，但是亞基內(nèi)連接重鏈和輕鏈的二硫鍵不容易被硫醇裂解。同樣IgA單體和IgG重鏈和輕鍵間的二硫鍵也不容易被硫醇試劑裂解。巰基試劑能裂解IgM型抗體，使其成為IgM亞基單體，而不會(huì)造成IgG抗體的減少。輸血科常用試劑有二硫蘇糖醇（DTT）和2-巰基乙醇（2-Me）。
適用場(chǎng)景一
產(chǎn)前檢查同種免疫抗體引起的HDFN的可能性。
1、定義：胎兒新生兒溶血病(HDFN)是指因胎母血型不合，通過(guò)胎母輸血，母體針對(duì)與其不同的胎兒紅細(xì)胞血型抗原產(chǎn)生相應(yīng)抗體經(jīng)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，導(dǎo)致胎兒或新生兒同種免疫性溶血引起的一系列臨床癥狀。
2、適用范圍：Rh及ABO血型系統(tǒng)血型不合引起的溶血病最常見(jiàn)。其他血型系統(tǒng)，如MNSs、Kell、Kidd、Duffy、Lewis、Diego等血型系統(tǒng)也可導(dǎo)致新生兒溶血病。而ABO-HDFN和抗-M-HDFN目前較常見(jiàn)的、可發(fā)生第一胎，母體常常存在IgM+IgG的抗-A/B、抗-M，進(jìn)行母體血抗體效價(jià)檢測(cè)時(shí)，需要使用巰基試劑滅活I(lǐng)gM抗體活性，以便檢測(cè)共存的IgG抗體。
3、操作步驟：
3.1 0.2M的2-Me或0.01mol/L DTT與受檢母體血清在試管內(nèi)等量混合，加塞置室溫30分鐘（或37℃ 10分鐘）
3.2 處理后血清用鹽水倍量稀釋?zhuān)抗?0μl，稀釋到第10管
3.3 每管加相應(yīng)3%（A/B/MN）紅細(xì)胞鹽水懸液50μl，以3400轉(zhuǎn)／分1000g離心后15秒后，肉眼觀察，記錄鹽水介質(zhì)凝集效價(jià)
3.4 37℃孵育30分鐘，三洗，用抗人球法檢測(cè)IgG抗體效價(jià)
4、結(jié)果判定：當(dāng)抗球蛋白介質(zhì)凝集效價(jià)大于等于鹽水介質(zhì)凝集效價(jià)二管（4倍）時(shí)，可以認(rèn)為抗球蛋白介質(zhì)凝集效價(jià)即為IgG抗體效價(jià)。
注意事項(xiàng)：由于開(kāi)始血清已被2-Me稀釋1倍，因此倍比稀釋的第一管時(shí)為4倍稀釋。
適用場(chǎng)景二
解離IgM抗體引起的自身凝集[1]
1、原理：巰基試劑可以裂解將單體亞單位連接成五聚體IgM分子的二硫鍵，這種五聚體分子可以呈冷凝集自身抗體性質(zhì)，與自身紅細(xì)胞的反應(yīng)發(fā)生凝集。巰基試劑可以消除紅細(xì)胞的自發(fā)凝集，為血型提供不凝集的標(biāo)本。
2、適用范圍：本方法常用于IgM抗體致敏的紅細(xì)胞干擾ABO血型正定型。
3、操作步驟：
3.1 用生理鹽水稀釋紅細(xì)胞濃度為50%。
3.2 在紅細(xì)胞中加入等量的0.01mol/L DTT或0.1mol/L 2-ME。
3.3 37℃孵育10min(2-ME)或15min(DTT)。
3.4 用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次。
3.5 用生理鹽水將紅細(xì)胞稀釋至適合的濃度，用于血型檢測(cè)。
適用場(chǎng)景三
處理紅細(xì)胞后進(jìn)行自身抗體的吸收
1、原理：ZZAP試劑由1%半胱氨酸激活的木瓜酶溶液、0.2M DTT,PH 6.5 PBS組成，聯(lián)合應(yīng)用蛋白酶（木瓜酶或無(wú)花果酶）和二硫蘇糖醇（DTT），破壞和解離紅細(xì)胞膜上抗體。IgG分子經(jīng)巰基試劑處理后增加對(duì)蛋白酶消化的敏感性。當(dāng)包被了IgG分子紅細(xì)胞用ZZAP 試劑處理后，IgG分子失去其完整性，并從紅細(xì)胞膜上解離下來(lái)，蛋白酶的作用是增加處理后紅細(xì)胞的吸收能力。
2、適用范圍：用于在免疫溶血性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷中處理紅細(xì)胞，用于吸附除去血清標(biāo)本中游離的溫自身抗體和冷自身抗體，對(duì)其中的同種異體抗體進(jìn)行檢測(cè)。也可用于消除自身紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。
3、操作步驟：
3.1冷抗體自身吸收
3.1.1 將ZZAP試劑2m1加入2m1壓積的自身紅細(xì)胞，混合，37℃，20-30min。
3.1.2 生理鹽水洗滌3次，最后一次徹底去除上清。
3.1.3 加入2m1自身血清，混合，4℃，30-40min。
3.1.4 900-1000g離心4-5min，將血清移至另一干凈的試管中。
3.1.5 如吸收效果不滿(mǎn)意，可重復(fù)步驟3.1.1至3.1.4。
3.1.6 最后一次吸收后用試劑紅細(xì)胞檢測(cè)血清中的同種異體抗體。
3.2 溫自身抗體的自身吸收
3.2.1取兩支試管，各加1m1壓積的自身紅細(xì)胞，2m1 ZZAP試劑混合，不時(shí)搖動(dòng)試管，37℃，20-30min。
3.2.2生理鹽水洗滌細(xì)胞3次，最后一次徹底除去上清。
3.2.3加入同體積血清至ZZAP 處理過(guò)的紅細(xì)胞，混合，37℃，20-45min。
3.2.4 900-1000g離心4-5min，收集血清。
3.2.5重復(fù)步驟3、4，將血清再吸收一次，離心，收集血清。
3.2.6用該血清與紅細(xì)胞譜試劑反應(yīng)，檢測(cè)同種異體抗體。
3.3.ZZAP處理異源紅細(xì)胞吸收病人自身抗體
3.3.1 R1R1、R2R2、rr三種O型紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，離心壓積，去除上清。
3.3.2 每一體積細(xì)胞加入兩體積的ZZAP試劑，混勻，37℃，20-30min，不斷搖動(dòng)。
3.3.3 生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，最后一次徹底去除上清。
3.3.4 將處理的紅細(xì)胞與病人血清同體積混合，37℃，30-60min，不斷搖動(dòng)。
3.3.5 900-1000g離心4-5min，收集血清。
3.3.6 將吸收過(guò)的血清與新的紅細(xì)胞（與吸收用的紅細(xì)胞為同一人份）混合，如反應(yīng)，重復(fù)吸收過(guò)程直至無(wú)反應(yīng)。
3.3.7 用吸收過(guò)的血清與紅細(xì)胞譜試劑反應(yīng)，檢測(cè)同種異體抗體。比較存在和除去的同種異體抗體活性。
適用場(chǎng)景四
處理紅細(xì)胞后進(jìn)行抗體檢測(cè)
1、原理：二硫蘇糖醇（DTT）是有效的還原劑，能破壞半胱氨酸殘基之間的共價(jià)鍵，從而影響抗原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)識(shí)別抗原的抗體在抗原蛋白結(jié)構(gòu)破壞后不與該抗原反應(yīng)。KELL血型系統(tǒng)抗原對(duì)DTT非常敏感。Knops血型系統(tǒng)抗體及抗-LWa,抗 -Yta, 抗-Ytb, 抗-Doa, 抗-Dob, 抗-Gya, 抗-Hy和抗-Joa等抗體不與DTT處理后的細(xì)胞處理。
2、適用范圍：這種抑制技術(shù)有助于識(shí)別部分抗體或確定血清是否含有其他潛在的同種抗體和靶向藥物達(dá)雷妥尤（抗-CD38）干擾的不規(guī)則抗體篩選、交叉配血等血清學(xué)試驗(yàn)。
3、操作步驟
3.1 DTT溶液（0.2 M DTT ，pH 8）和PBS洗滌的壓積紅細(xì)胞以4：1混合。
3.2 在37℃孵育30～45分鐘,每5分鐘混勻一次。推薦30min以上
3.3 用PBS洗滌4次�？赡馨l(fā)生輕微的溶血；如果溶血過(guò)多，可使用略小體積的DTT（2-3倍體積）洗滌新鮮的紅細(xì)胞，重復(fù)以上步驟。推薦3400r，1min
3.4 用PBS制成2%～5%紅細(xì)胞懸液。
3.5 用含有可疑抗體的血清測(cè)試DTT處理的細(xì)胞。
3.6 選擇E+紅細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞，K+紅細(xì)胞為陰性對(duì)照。DTT處理后分別用抗-E和抗-K血清測(cè)試對(duì)應(yīng)的細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性細(xì)胞陰性反應(yīng)才可證明DTT處理有效。
適用場(chǎng)景五
轉(zhuǎn)化IgG型抗體直接凝集細(xì)胞[2]
1、原理：IgG型抗體分子有抗體重鏈和兩條輕鏈由二硫鍵（S-S）連接而成。使用巰基試劑去除連接在兩條重鏈的二硫鍵能增加IgG鉸鏈區(qū)的靈活性，能增加IgG分子的Fab端抗原結(jié)合位點(diǎn)之間的距離，修飾后的IgG型分子在低蛋白介質(zhì)（鹽水）中能直接凝集紅細(xì)胞。
2、適用范圍：將紅細(xì)胞致敏后不能導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集效價(jià)≥32的IgG型抗體轉(zhuǎn)化為能直接凝集紅細(xì)胞的IgG型抗體。
3、操作步驟：
3.1 準(zhǔn)備2支試管分別加入1mL含有效價(jià)≥32的IgG型抗體的血清。
3.2 1支試管中加入1mL 0.01mol/L DTT，另一支對(duì)照試管中加入1mL pH 7.3 PBS。
3.3 室溫孵育30分鐘或37℃ 15min。
3.4 加入存在該IgG型抗體特異性抗原的紅細(xì)胞后立即離心 3100r/min 15秒，立即肉眼觀察并記錄結(jié)果。
4.注意事項(xiàng)：
1）對(duì)照管不能凝集紅細(xì)胞說(shuō)明試驗(yàn)成立。
2）檢測(cè)管血清能直接凝集紅細(xì)胞，說(shuō)明IgG型抗體轉(zhuǎn)化成功；如檢測(cè)管血清不能直接凝集紅細(xì)胞，說(shuō)明IgG型抗體轉(zhuǎn)化不成功，可能因?yàn)榭贵w效價(jià)低的原因。
參考文獻(xiàn)：
[1] 沈偉，陳偉．劉鳳霞.紅細(xì)胞血清學(xué)技術(shù) [M].長(zhǎng)沙：中南大學(xué)出版社，2022：176.
[2] W John Judd, Susan T Johnson, Jill Storry, et al. Judd's Methods in Immunohematology 3rd[M]. Bethesda MD:AABB Press, 2008,p239.
