蛋白測(cè)序 的主要策略是采用化學(xué)或者酶消化方法將多肽鏈拆分，然后測(cè)定氨基酸殘基含量和組成。本文詳述了蛋白質(zhì)測(cè)序的概念，蛋白測(cè)序的步驟以及蛋白N-端測(cè)序服務(wù)等。

一、概念

當(dāng)前，所謂蛋白質(zhì)測(cè)序 ，主要指的是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（Primary structure）包括組成蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目。很多場(chǎng)合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)氨基酸順序的測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)知道約十萬(wàn)個(gè)不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

二、測(cè)定步驟

1.多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須強(qiáng)行拆分。幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱(chēng)為寡聚蛋白質(zhì)，如：血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈（亞基）。

2.測(cè)定蛋白質(zhì)分子 中多肽鏈的數(shù)目。通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。

3.二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的beta-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。

4.測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比。

5.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。

多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：N-端氨基酸（amino-terminal）和C-端氨基酸（Carboxyl-terminal） 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法;酶降解法;硼氫化鋰法）。

6.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段�？刹捎脙煞N或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開(kāi)來(lái)。

7.測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序。

8.確定肽段在多肽鏈中的次序。

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

一般采用胃蛋白酶處理沒(méi)有斷開(kāi)二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過(guò)甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

三、蛋白質(zhì)N-端測(cè)序服務(wù) 

幾乎所有的蛋白合成都起始于N-端，蛋白質(zhì)N-端的序列組成對(duì)于蛋白質(zhì)整體的生物學(xué)功能有著巨大的影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)的半衰期，同時(shí)關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等，這些與蛋白的功能和穩(wěn)定息息相關(guān)，對(duì)蛋白進(jìn)行N-端測(cè)序分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。 

目前對(duì)蛋白N端測(cè)序主要分類(lèi)兩大類(lèi)，其一為非質(zhì)譜技術(shù)，例如經(jīng)典的Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對(duì)應(yīng)蛋白的cDNA，再來(lái)反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用的長(zhǎng)處和制約之處，目前，市面上采用的，依然是基于經(jīng)典的Edman降解法原理，利用美國(guó)ABI公司Procise491蛋白序列測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測(cè)序。

蛋白質(zhì)N-端測(cè)序服務(wù)說(shuō)明

基于Edman降解法原理進(jìn)行蛋白質(zhì)N-端測(cè)序，從理論上不可避免的受到兩種條件制約，會(huì)很大程度上影響蛋白測(cè)序質(zhì)量：

1.樣品純度不能太低，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為純度大于90%的蛋白才適用于測(cè)序反應(yīng)。

2.N端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行Edman反應(yīng)，無(wú)法測(cè)序。

蛋白質(zhì)合成是從N末端開(kāi)始的，因此分析蛋白質(zhì)合成是從N末端序列對(duì)蛋白序列分析很重要，蛋白質(zhì)N端序列主要是通過(guò)Edman降解法和質(zhì)樸技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。