聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,為常用的分子生物學技術(shù)之一。其基本步驟是,首先將待擴增的模板DNA變性使之成為單鏈,DNA樣品中,特異性的引物能夠與其互補的序列雜交,在dNTPs和Taq酶存在時,就可以合成模板DNA的互補鏈,反應完成后,將反應混合物加熱使DNA雙鏈變性,溫度下降后,過量的引物又可以開始第二輪的合成反應。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復多次,使所需要的DNA片段得到特異性的擴增。
PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地擴增模板DNA序列。因此,引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。
要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu),就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu),那就可以在這一區(qū)域設計引物。
現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基,擴增片段長度為100~600堿基對。讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區(qū)域設計引物。同時引物之間也不能有互補性,一般一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的互補。
引物確定以后,可以對引物進行必要的修飾,例如可以在引物的5′端加酶切位點序列;標記生物素、熒光素等,這對擴增的特異性影響不大。但3′端絕對不能進行任何修飾,因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位,因為密碼子第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增的特異性與效率。
綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設計原則:
①引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。
②產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。
③引物長度一般在15~30堿基之間。
④G+C含量在40%~60%之間。
⑤堿基要隨機分布。
⑥引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑦引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
⑧引物5′端可以修飾。
⑨引物3′端不可修飾。
⑩引物3′端要避開密碼子的第3位。