一、概要

用來檢測呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù)，采用AOZ衍生物的特異性抗體，具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度，較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點在檢測中很好的表現(xiàn)出來。（本試劑盒的檢測時間為1.5小時。）

二、試驗原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留的AOZ經(jīng)衍生化后和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。

三、適用范圍

可定性、定量檢測動物組織（雞、豬、牛等）、牛奶、蜂蜜和雞蛋樣本中的呋喃唑酮代謝物的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率

呋喃唑酮代謝物……………………………………   100%

呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%

呋喃妥因代謝物…………………………………小于 0.1%

硝基糠腙（呋喃西林）代謝物…………………小于0.1%

呋喃唑酮…………………………………………………16.3%

呋喃它酮………………………………………………小于1%

呋喃妥因………………………………………………小于1%

硝基糠腙（呋喃西林）………………………………小于1%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑

設(shè)備：

┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm

┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置

┅┅均質(zhì)器

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機(jī)

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶： 100ml、1L

┅┅玻璃試管：10ml

┅┅聚苯乙烯離心管：2ml、10ml、50ml

┅┅微量移液器：單道 20ml～200ml、100ml～1000ml

多道 250ml

試劑：

┅┅乙酸乙酯（分析純）

┅┅正己烷（或正庚烷）（分析純）

┅┅三水合磷酸氫二鉀（分析純）

┅┅濃鹽酸

┅┅氫氧化鈉（分析純）

┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析純）（供奶、雞蛋樣用）

┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)（供奶、雞蛋樣用）

┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑

1、96孔酶標(biāo)板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）

  0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb       3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：（1ml/瓶） 100ppb

4、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液      1.5ml …………………… 紅色帽

5、抗體濃縮液        0.8ml……………………綠色帽

6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽

7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽

8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽

9、20×濃縮洗滌液    40ml………………………透明帽

10、2×濃縮復(fù)溶液    50ml……………………藍(lán)色帽

11、2-硝基苯甲醛       15.1mg……………………黑色帽

七、溶液的配制

配液1: 衍生化試劑

向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml（濃度為10mM）。

配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液

            稱取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。

配液3: C液（供奶樣、雞蛋用）：

0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液

             稱取10.7g 亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml

      D液（供奶樣、雞蛋用）：

1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液

             稱取28.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml

配液4: 1M鹽酸溶液      

量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。

配液5: 1M 氫氧化鈉溶液

        稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。

配液6: 復(fù)溶工作液

用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1：1體積比進(jìn)行稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于抗體濃縮液、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的稀釋及提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液7: 洗滌液工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進(jìn)行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。

八、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否潔凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

（c）衍生化試劑可于2-8℃保存半年。

（d）磷酸氫二鉀溶液可于2-8℃保存三個月

（e）鹽酸溶液可于室溫保存三個月

（f）氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個月

（g）未處理的樣本冷凍保存。

（h）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時。

（i）雞蛋樣本前處理過程中，50℃水浴2小時，中間每半小時必須用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘，它直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（一）肌肉、肝臟組織前處理方法

┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；

┅┅接(四)的描述方法。

注：樣本應(yīng)當(dāng)在陰涼避光處冷藏保存

（二）牛奶前處理方法

┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；

┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中；

┅┅分別加入250ml C液和250ml D液（見配液3）；

┅┅用振蕩器充分振蕩混合，3000g以上，4~12 oC（39-54℉）離心10min。如果沒有恒溫離心機(jī)，則先將樣本降溫至大約8 oC（46℉），然后離心；

┅┅接(四)的描述方法

（三）蜂蜜前處理方法

┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；

┅┅用4ml去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；

┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩；

┅┅接(四)第二步描述方法（標(biāo) * 處）。

（四）接上面的方法

┅┅稱取1.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本（肝樣/肉樣）、制備好的牛奶樣本上清液1.1ml（相當(dāng)于1ml的奶樣），分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）和100ml衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩2min；

*┅┅在37 oC過夜孵育（大約16h）；

┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）和5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s；

┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；

┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入1ml復(fù)溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動1min充分混勻；

┅┅3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。

（五）雞蛋前處理方法

┅┅用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋)；

┅┅稱取2.0±0.05g均質(zhì)過的蛋樣本至10ml聚苯乙烯離心管中，分別加入4ml去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液（見配液4）、200µl C液（見配液3），用振蕩器振蕩1min混勻；

┅┅加入200µl D液（見配液3），用振蕩器充分振蕩5min，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取全部上清液至15ml聚苯乙烯離心管中，加入200µl衍生化試劑（見配液1），用振蕩器充分振蕩，50℃水浴2h（中間每半小時用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘）；

┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液（見配液2）、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液（見配液5）5ml乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s，3000g以上，室溫（20-25 oC/68-77℉）離心10min；

┅┅取2.5ml上層有機(jī)相，于50～60℃氮氣流下吹干；

┅┅加入1ml正己烷（或正庚烷），用渦旋儀渦動30s，再加入2ml復(fù)溶工作液（見配液6），用渦旋儀渦動1min充分混勻；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，請于60℃水浴中加熱5min，再重復(fù)離心）；

┅┅除去上層有機(jī)相，取下層水相50µl用于分析。

九、檢測步驟

測定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

 操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、抗體工作液的稀釋：將抗體濃縮液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份抗體濃縮液加入10份復(fù)溶工作液）。

6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對應(yīng)的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

7、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見配液7）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。

8、酶標(biāo)二抗工作液的稀釋：將酶標(biāo)二抗?jié)饪s液用復(fù)溶工作液按照1：10體積比進(jìn)行稀釋（1份酶標(biāo)二抗?jié)饪s液加入10份復(fù)溶工作液）。

9、加酶標(biāo)二抗：加入酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟7。

10、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見注意事項8）。

11、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310，樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.104；0.05ppb為1.224；0.15ppb為0.859；0.45ppb為0.522； 1.35ppb為0.270；4.05ppb為0.129。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

樣本稀釋倍數(shù)

肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數(shù)：2

奶樣樣品稀釋倍數(shù)：2

蜂蜜樣品的稀釋倍數(shù)：2

雞蛋樣品的稀釋倍數(shù)：2  

十一、檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：0.05ppb

樣本最低檢測限：

組織、蜂蜜 ……………………………………………0.1ppb

雞蛋、奶樣………………………………………………0.1ppb

準(zhǔn)確度：

肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%

蜂蜜 …………………………………………… 90±15%

雞蛋 …………………………………………… 90±20%

奶樣………………………………………………… 90±10%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。