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一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下,不斷的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝.如果同化作用的速度超過了異化作用,則其原生質(zhì)的總量(重量,體積,大小)就不斷增加,于是出現(xiàn)了個(gè)體的生長(zhǎng)現(xiàn)象.如果這是一種平衡生長(zhǎng),即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí),則達(dá)到一定程度后就會(huì)發(fā)生繁殖,從而引起個(gè)體數(shù)目的增加,這時(shí),原有的個(gè)體已經(jīng)發(fā)展成一個(gè)群體.隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng),就引起了這一群體的生長(zhǎng),這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來衡量.微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng),微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科研上有一定困難,通常情況下也沒有實(shí)際意義.微生物是以量取勝的,因此,微生物的生長(zhǎng)通常指群體的擴(kuò)增.
微生物的生長(zhǎng)繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映.因此生長(zhǎng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問題的重要指標(biāo),同時(shí),微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病,霉腐微生物的防治都和他們的生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān).所以有必要介紹一下微生物生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法.既然生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加,所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù),而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上.微生物生長(zhǎng)的衡量,可以從其重量,體積,密度,濃度,做指標(biāo)來進(jìn)行衡量.
一、生長(zhǎng)量測(cè)定法
1、體積測(cè)量法:又稱測(cè)菌絲濃度法.
通過測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長(zhǎng)狀況.方法是,取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液(如 10毫升)放在有刻度的離心管中,設(shè)定一定的離心時(shí)間(如5分鐘)和轉(zhuǎn)速(如5000 rpm),離心后,倒出上清夜,測(cè)出上清夜體積為v,則菌絲濃度為(10-v)/10.菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo).這種方法比較粗放,簡(jiǎn)便,快速,但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件,否則偏差很大,由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物,結(jié)果會(huì)有一定偏差.
2、稱干重法:
可用離心或過濾法測(cè)定.一般干重為濕重的10-20%.在離心法中,將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中,設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速,進(jìn)行離心,并用清水離心洗滌1-5次,進(jìn)行干燥.干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干,或采用紅外線烘干,也可在80℃或40℃下真空干燥,干燥后稱重.如用過濾法,絲狀真菌可用濾紙過濾,細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾,過濾后用少量水洗滌,在40℃下進(jìn)行真空干燥.稱干重發(fā)法較為煩瑣,通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí),常采用這種方法,如活性干酵母(activity dry yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料.
3、比濁法:
微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高.通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值,判斷微生物的生長(zhǎng)狀況.對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí),可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶.將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中,即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況,而不必取菌液.該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè).如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì),在波長(zhǎng)600nm 處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600,以此監(jiān)控E.Coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間.
4、菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法:
對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌,可以在培養(yǎng)基上測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度,或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管,到入合適的培養(yǎng)基,臥放,在開口的一端接種微生物,一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度,借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng).
二、微生物計(jì)數(shù)法
1、血球計(jì)數(shù)板法:
血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片,玻片上有四條溝和兩條嵴,中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái),兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm,每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng),中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格.通過油鏡觀察,統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量,即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù).這種方法簡(jiǎn)便,直觀,快捷,但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù),并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù).
2、染色計(jì)數(shù)法:
為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足,人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法.借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液,染色后在顯微鏡下觀察,活細(xì)胞為無色,而死細(xì)胞為藍(lán)色.
3、比例計(jì)數(shù)法:
將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細(xì)胞濃度.這種計(jì)數(shù)方法比較粗放.并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn).
4、液體稀釋法:
對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計(jì)數(shù),從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共 15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù),然后查最大或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量.該法常用于食品中微生物的檢測(cè),例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查.
5、平板菌落計(jì)數(shù)法:
這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法.將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋,取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合,或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上.保溫培養(yǎng)后,用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度,即可算出原菌液的含菌數(shù).一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn) 50-500個(gè)菌落為宜.但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術(shù).平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng),獲得了單克隆.
6、試劑紙法:
在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用.形式有小型厚濾紙片,瓊脂片等.在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基,其中加入活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,無色)待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng).短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量.試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差.
7、膜過濾法:
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經(jīng)丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光,活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光.
8、生理指標(biāo)法:
微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,例如酸堿度,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,產(chǎn)氣量等,與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多,它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值.
9、測(cè)定含氮量:
大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,霉菌為6.0%.根據(jù)含氮量×6.25,即可測(cè)定粗蛋白的含量.含氮量的測(cè)定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法.Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合,在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?收集在呼吸計(jì)中,用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量.
10、測(cè)定含碳量:
將少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻.加水稀釋至5毫升,在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值,即可推算出生長(zhǎng)量.需用試劑做空白對(duì)照,用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線.
11、還原糖測(cè)定法:
還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè).方法是,離心發(fā)酵液,取上清液,加入斐林試劑,沸水浴煮沸3分鐘,取出加少許鹽酸酸化,加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液,繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn),查表讀出還原糖的含量.
12、氨基氮的測(cè)定:
方法是:離心發(fā)酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應(yīng)數(shù)刻,加入0.02N的使之變色,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量.根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況.
13、其他生理物質(zhì)的測(cè)定:
P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)),耗氧,黏度,產(chǎn)熱等指標(biāo),都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定.也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化,最終產(chǎn)氣量,微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng).如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上,隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化,判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì).
三、商業(yè)化微生物快速檢測(cè)法
微生物的檢測(cè),其發(fā)展方向是快速,準(zhǔn)確,簡(jiǎn)便,自動(dòng)化,當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理,結(jié)合不同的檢測(cè)方法,設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備,正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域.
1、抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題,為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).中科院廣州分院合作產(chǎn)業(yè)處提供的抗干擾微生物培養(yǎng)基,新型生化鑒定管,微生物計(jì)數(shù)卡,環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等,可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè).
2、BACTOMETER 全自動(dòng)各類總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果,樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù),對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(IMPEDANCE TECHNOLOGY)將待測(cè)樣本與培養(yǎng)基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi),底部有一對(duì)不銹鋼電極,測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變.如微生物生長(zhǎng)時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子,電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化,從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量.測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù),酵母菌,大腸桿菌群,霉菌,乳酸菌,嗜熱菌,革蘭氏陰性菌,金黃色葡萄球菌等.
這些儀器和設(shè)備的生產(chǎn)廠家很多,產(chǎn)品各異,在此不做一一介紹,具體可查看各公司的產(chǎn)品說明.
