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一、PCR實驗室裝修知識
這里著重介紹PCR實驗室裝修的功能區(qū)劃分，建議從3方面來考慮，即：普通實驗區(qū)、污染控制區(qū)、氣流組織。
1.普通實驗區(qū)
包括產(chǎn)物分析區(qū)、擴增區(qū)、樣品制備區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)這4個區(qū)域。
2.污染控制區(qū)
此區(qū)域的規(guī)劃有3套方案，第1套為各功能間相互串通，以套間方式進入人流/物流；第2套為設(shè)置獨立緩沖間，人流/物流分道，流程相鄰間設(shè)置物流傳遞窗；第3套為設(shè)置共用緩沖間/緩沖走廊。
3.氣流組織
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單相的實驗工藝流、物流、人流和氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。PCR實驗室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證個實驗區(qū)的壓力要求。
PCR實驗室裝修的氣流組織需要從原始試劑混配室、DNA提取室、PCR擴增室、檢測室、送風(fēng)口這5方面來考慮。
①原始試劑混配室：房間壓差為正壓，配備有潔凈工作臺，以防止其他功能間對本房間的污染。
②DNA提取室：房間壓差為負壓，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止提取核酸產(chǎn)生的氣溶膠對工作人員的傷害及擴散污染。
③PCR擴增室：房間壓差為負壓，與DNA提取室一樣，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止擴增產(chǎn)物造成的擴散污染。
④檢測室：房間壓差為負壓，與DNA提取室、PCR擴增室一樣，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止相關(guān)污染。
⑤送風(fēng)口：采用的是頂送風(fēng)，側(cè)下回/排風(fēng)方式。
二、PCR實驗室設(shè)計知識
這里著重介紹PCR走廊、傳遞窗這2方面的最新知識。
1、PCR走廊
PCR走廊并不是標(biāo)配，進深不夠時不要做PCR走廊，且PCR走廊會增加交叉污染。
Tips：這4個分區(qū)(試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、核算擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū))原本就不需連接在一起，且在物理空間上必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。
2、傳遞窗
并非必須設(shè)置(只要不涉及潔/污分流就不需要設(shè)置傳遞窗)，但一般實驗機構(gòu)/實驗人員喜歡設(shè)置。
Tips：傳遞窗的本質(zhì)—同緩沖間，是物流的緩沖間。在PCR實驗室設(shè)計中，試劑準(zhǔn)備和標(biāo)本制備間是重點保護的區(qū)域，此處最好不要加傳遞窗，防止交叉污染。實驗中的污染風(fēng)險主要來自于核酸擴增時的加樣行為，但由于操作在生物安全柜(起超凈臺的作用，最新做法)內(nèi)進行，且確保空氣不外溢，因此不存在污染。
三、PCR實驗室的管理要點：
1、樣品制備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的制備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施；
未設(shè)緩沖間時工作區(qū)域為負壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。所有的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過徹底清洗并消毒，防止交叉污染。主要設(shè)備有冰箱、生物安全柜（或潔凈工作臺、排風(fēng)柜）、離心機、加樣器、振蕩器、恒溫水浴、上下水裝置、廢棄物容器、紫外燈。根據(jù)制備樣品的性質(zhì)和要求決定操作臺是選用生物安全柜、潔凈工作臺還是排毒柜，如疾病控制中心、臨床醫(yī)學(xué)實驗室一般選用生物安全柜，植物轉(zhuǎn)基因、檢疫等可選用排毒柜樣品制備需要較高潔凈條件的選用潔凈工作臺。
1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的產(chǎn)物DNA克隆不能在這個房間操作。
2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。
3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
4）DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
5）大體積樣品應(yīng)該用單獨包裝的無菌一次性移液管吸取。
6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。
7）任何時候都應(yīng)該穿實驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、前PCR區(qū)
必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實驗室試劑的操作
未設(shè)緩沖間的試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域為正壓。用于擴增的試劑應(yīng)冰凍儲存。主要設(shè)備有天平、冰箱、離心機、加樣器、振蕩器、紫外燈。
1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。
2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入貯存的試劑0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應(yīng)。
4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實驗一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。
5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗。
7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實驗室只涉及到擴增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
2）如果你的實驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
3）作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。
4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
5）當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點應(yīng)該予以考慮。
6、后PCR區(qū)
PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實驗室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。
