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誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群,促進(jìn)其突變率大幅度提高,然后采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株,以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)研究用. 當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他生產(chǎn)單位所使用的高產(chǎn)菌株,幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的菌株.誘變育種除能提高產(chǎn)量外,還可達(dá)到改善產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化生產(chǎn)工藝等目的.誘變育種具有方法簡單、快速和收效顯著等特點(diǎn),故仍是目前被廣泛使用的主要育種方法之一.
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容:
目的:
以紫外線誘變獲得用于醬油生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌株為例,學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法.
內(nèi)容:
1．對米曲霉(Aspergills oryzae )出發(fā)菌株進(jìn)行處理,制備孢子懸液.
2．用紫外線進(jìn)行誘變處理.
3．用平板透明圈法進(jìn)行兩次初篩.
4．用搖瓶法進(jìn)行復(fù)篩及酶活性測定.
二、實(shí)驗(yàn)材料和用具:
米曲霉斜面菌種；
豆餅斜面培養(yǎng)基、酪素培養(yǎng)基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；
三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養(yǎng)皿(9cm)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精燈.
三、操作步驟:
(一)出發(fā)菌株的選擇及菌懸液制備:
1、出發(fā)菌株的選擇:
可直接選用生產(chǎn)醬油的米曲霉菌株,或選用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株.
2、菌懸液制備:
取出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接至豆餅斜面培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)3～5d 活化.然后孢子洗至裝有1mL 0.lmol/L pH6.0 的無菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠,裝量以大致鋪滿瓶底為宜),30℃振蕩30min,用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾,制成把子懸液,調(diào)其濃度為106～108 個(gè)/mL,冷凍保藏備用.
(二)誘變處理:
用物理方法或化學(xué)方法,所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定,有時(shí)還可采用復(fù)合處理,可獲得更好的結(jié)果.本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用紫外線照射的誘變方法.
1、紫外線處理:
打開紫外燈(30W)預(yù)熱20min.取5mL 菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿(9cm)中,同時(shí)制作5 份.逐一操作,將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上,照射l min 后打開培養(yǎng)皿蓋,開始照射,與照射處理開始的同時(shí)打開磁力攪拌器進(jìn)行攪拌,即時(shí)計(jì)算時(shí)間,照射時(shí)間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min.照射后,誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h 然后在紅燈下稀釋涂菌進(jìn)行初篩.
2、稀釋菌懸液:
按10 倍稀釋至10-6,從10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培養(yǎng)基平板中(每個(gè)稀釋度均做3 個(gè)重復(fù)),然后涂菌并靜置,待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置,于30℃恒溫培養(yǎng)2～3d.
(三)優(yōu)良菌株的篩選:
1、初篩:
首先觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小,并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比,選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50 個(gè),作為復(fù)篩菌株.
2、平板復(fù)篩:
分別倒酪素培養(yǎng)基平板,在每個(gè)平皿的背面用紅筆劃線分區(qū),從圓心劃線至周邊分成8 等份,1～7 份中點(diǎn)種初篩菌株,第8 份點(diǎn)種原始菌株,作為對照.培養(yǎng)48h 后即可見生長,若出現(xiàn)明顯的透明圈,即可按初篩方法檢測,獲得數(shù)株二次優(yōu)良菌株,進(jìn)大搖瓶復(fù)篩階段.
3、搖瓶復(fù)篩:
將初篩出的菌株,接入米曲霉復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),其方法是,稱取麥秩85g,豆餅粉(或面粉)15g,加水95～110mL(稱為潤水),水含量以手捏后指縫有水而不下滴為宜,于500mL 三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm),121℃濕熱滅菌30min,然后分別接入以上初篩獲得的優(yōu)良菌株,30℃培養(yǎng),24h 后搖瓶一次并均勻鋪開,再培養(yǎng)24～48h,共培養(yǎng)3～5d 后檢測蛋白酶活性.
4、蛋白酶的測定方法:
(1)取樣:培養(yǎng)后隨機(jī)稱取以上搖瓶培養(yǎng)物1g,加蒸餾水100mL,(或200mL),40℃水浴,浸酶1h,取上清浸液測定酶活性.另取lg 培養(yǎng)物于105℃烘干測定含水量.
(2)酶活性測定:30℃ pH7.5 條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白),每分鐘產(chǎn)酪氨酸1μg 為一個(gè)酶活力單位.計(jì)算公式為:
(A 樣品OD680nm 值-A 對照OD680nm 值)×K×V/t×N
K:標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收為“1”時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；
V:酶促反應(yīng)的總體積；
t: 酶促反應(yīng)時(shí)間(min)；
N:酶的稀釋倍數(shù).
5:谷氨酸的檢測:
此項(xiàng)檢測也是醬油優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一.
檢測培養(yǎng)基:豆餅粉:麩夫=6:4,潤水75%,121℃濕熱滅菌30min.
谷氨酸測定:于以上培養(yǎng)基中加入7%鹽水(W/V),40～45℃水浴,水解9d 后過濾,以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法).
四、注意事項(xiàng):
1、紫外線照射時(shí)注意保護(hù)眼睛和皮膚.
2、誘變過程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進(jìn)行,并在黑暗中培養(yǎng).
五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告:
1、試列表說明高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選過程和結(jié)果.
2、你認(rèn)為以上的篩選方法有什么優(yōu)缺點(diǎn),如何改進(jìn)？
六、問題和思考:
1、試述紫外線誘變的作用機(jī)理及其在具體操作中應(yīng)注意的問題.
2、為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養(yǎng)一段時(shí)間？
注:篩選菌株數(shù)的計(jì)算 若按突變率為0.01 計(jì)算,則一次篩選可取250—300 個(gè)菌落,
第一次篩選后可多選幾株高產(chǎn)株,而二級篩選為重點(diǎn)階段,其最適量可參考以下計(jì)算方法:如初篩菌株數(shù)為200 株,二次篩選欲選株數(shù)為2 株,則二級應(yīng)選(200×2)1/2,為20 株,這樣的數(shù)量選擇,使有可能從較少的數(shù)量中獲得相對較多的優(yōu)良菌株.
