（一）實驗目的：學習細菌的鞭毛染色法

（二）實驗原理：細菌的鞭毛極細，直徑一般為10—20nm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染劑處理，讓它沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色。常用的媒染劑由丹寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。現推薦以下兩種染色法。

（三）實驗器材

1.活材料：培養(yǎng)12-16h的水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae），粘質賽氏桿菌（Serratia marcescens）或假單細胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌種。

2.染色液和試劑：硝酸銀染色液（見附二、（一）、8）、Leifson染色液（見附二、（一—）、9）、香柏油、二甲苯。

3.器材：載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、玻片擱架、鑷子、接種環(huán)，顯微鏡。

（四）實驗方法

1.鍍銀法染色

（1）清洗玻片  選擇光滑無裂痕的玻片，最好選用新的。為了避免玻片相互重疊，應將玻片插在專用金屬架上，然后將玻片置洗衣粉過濾液中（洗衣粉煮沸后用濾紙過濾，以除去粗顆粒），煮沸20min。取出稍冷后用自來水沖洗、晾干，再放入濃洗液中浸泡5—6天，使用前取出玻片，用自來水沖去殘酸，再用蒸餾水洗。將水瀝干后，放入95%乙醇中脫水。

（2）菌液的制備及制片：菌齡較老的細菌容易失落鞭毛，所以在染色前應將待染細菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上（培養(yǎng)基表面濕潤，斜面基部含有冷凝水）連續(xù)移接3-5代，以增強細菌的運動力。最后一代菌種放恒溫箱中培養(yǎng)12—16h。然后，用接種環(huán)挑取斜面與冷凝水交接處的菌液數環(huán)，移至盛有1—2mL無菌水的試管中，使菌液呈輕度混濁。將該試管放在37℃恒溫箱中靜置10min（放置時間不宜太長，否則鞭毛會脫落），讓幼齡菌的鞭毛松展開。然后，吸取少量菌液滴在潔凈玻片的一端，立即將玻片傾斜，使菌液緩慢地流向另一端，用吸水紙吸去多余的菌液。涂片放空氣中自然干燥。

用于鞭毛染色的菌體也可用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。方法是將0.3-0.4%的瓊脂肉膏培養(yǎng)基熔化后倒入無菌平皿中，待凝固后在平板中央點接活化了3-4代的細菌，恒溫培養(yǎng)12-16h后，取擴散菌落的邊緣制作涂片。

（3）染色

①滴加A液，染4—6min。

②用蒸餾水充分洗凈A液。

③用B液沖去殘水，再加B液于玻片上，在酒精燈火焰上加熱至冒氣，約維持0.5—1min（加熱時應隨時補充蒸發(fā)掉的染料，不可使玻片出現干涸區(qū)）。

④用蒸餾水洗，自然干燥。

（4）鏡檢：先低倍，再高倍，最后用油鏡檢查。

結果：菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。

2.改良Leifson染色法

（1）清洗玻片法同1。

（2）配制染料  見附錄二（一）9。染料配好后要過濾15-20次后染色效果才好。

（3）菌液的制備及涂片

①菌液的制備同1。

②用記號筆在潔凈的玻片上劃分3—4個相等的區(qū)域。

③放1滴菌液于第一個小區(qū)的一端，將玻片傾斜，讓菌液流向另一端，并用濾紙吸去多余的菌液。

④干燥  在空氣中自然干燥。

（4）染色

①加染色液于第一區(qū)，使染料覆蓋涂片。隔數分鐘后再將染料加入第二區(qū)，依此類推（相隔時間可自行決定），其目的是確定最合適的染色時間，而且節(jié)約材料。

②水洗：在沒有傾去染料的情況下，就用蒸餾水輕輕地沖去染料，否則會增加背景的沉淀。

③干燥：自然干燥。

（5）鏡檢  先低倍觀察，再高倍觀察，最后再用油鏡觀察，觀察時要多找一些視野，不要企圖在1-2個視野中就能看到細菌的鞭毛。

結果：菌體和鞭毛均染成紅色。

（五）實驗作業(yè)：給出鞭毛菌的形態(tài)圖

（六）注意事項

1.鍍銀法染色比較容易掌握，但染色液必須每次現配現用，不能存放，比較麻煩。

2.Leifson染色法受菌種、菌齡和室溫等因素的影響，且染色液須經15-20次過濾，要掌握好染色條件必須經過一些摸索。

3.細菌鞭毛極細，很易脫落，在整個操作過程中，必須仔細小心，以防鞭毛脫落。

4.染色用玻片干凈無油污是鞭毛染色成功的先決條件。

附：細菌的運動性觀察

（一）實驗原理  細菌是否具有鞭毛是細菌分類鑒定的重要特征之一。采用鞭毛染色法雖能觀察到鞭毛的形態(tài)、著生位置和數目，但此法既費時又麻煩。如果僅須了解某菌是否有鞭毛，可采用懸滴法或水封片法（即壓滴法）直接在光學顯微鏡下檢查活細菌是否具有運動能力，以此來判斷細菌是否有鞭毛。此法較快速、簡便。

懸滴法就是將菌液滴加在潔凈的蓋玻片中央，在其周邊涂上凡士林，然后將它倒蓋在有凹槽的載玻片中央，即可放置在普通光學顯微鏡下觀察。水封片法是將菌液滴在普通的載玻片上，然后蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。

大多數球菌不生鞭毛，桿菌中有的有鞭毛有的無鞭毛，弧菌和螺菌幾乎都有鞭毛。有鞭毛的細菌在幼齡時具有較強的運動力，衰老的細胞鞭毛易脫落，故觀察時宜選用幼齡菌體。

（二）實驗器材

1.活材料：培養(yǎng)12-16h小時的枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、假單胞菌（Pseudomonas sp.）。

2.試劑：香柏油、二甲苯、凡士林等。

3.器材：凹載玻片、蓋玻片、鑷子、接種環(huán)、滴管、擦鏡紙、顯微鏡。

（三）實驗方法：

1.制備菌液：在幼齡菌斜面上，滴加3-4mL無菌水，制成輕度混濁的菌懸液。

2.涂凡士林：取潔凈無油的蓋玻片1塊，在其四周涂少量的凡士林。

3.滴加菌液：加1滴菌液于蓋玻片的中央，并用記號筆在菌液的邊緣做一記號，以便在顯微鏡觀察時，易于尋找菌液的位置。

4.蓋凹玻片  將凹玻片的凹槽對準蓋玻片中央的菌液，并輕輕地蓋在蓋玻片上，使兩者粘在一起，然后翻轉凹玻片，使菌液正好懸在凹槽的中央，再用鉛筆或火柴棒輕壓蓋玻片，使玻片四周邊緣閉合，以防菌液干燥。

若制水封片，在載玻片上滴加一滴菌液，蓋上蓋玻片后即可置顯微鏡下觀察。

5.鏡檢  先用低倍鏡找到標記，再稍微移動凹玻片即可找到菌滴的邊緣，然后將菌液移到視野中央換高倍鏡觀察。由于菌體是透明的，鏡檢時可適當縮小光圈或降低聚光器以增大反差，便于觀察。鏡檢時要仔細辨別是細菌的運動還是分子運動（即布朗運動），前者在視野下可見細菌自一處游動至他處，而后者僅在原處左右擺動。細菌的運動速度依菌種不同而異，應仔細觀察。

結果：有鞭毛的枯草桿菌和假單胞菌可看到活躍的運動，而無鞭毛的金黃色葡萄球菌不運動。

（四）實驗作業(yè)：繪出所看到的細菌的形態(tài)圖，并用箭頭表示其運動方向。

（五）注意事項

1.檢查細菌運動的載玻片和蓋玻片都要潔凈無油，否則將影響細菌的運動。

2.制水封片時菌液不可加得太多，過多的菌液會在蓋玻片下流動，因而在視野內只見大量的細菌朝一個方向運動，從而影響了對細菌正常運動的觀察。

3.若使用油鏡觀察，應在蓋玻片上加香柏油一滴。