原理
免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴(kuò)散兩種方法的結(jié)合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進(jìn)行電泳,使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開(kāi),然后加入抗體做雙相免疫擴(kuò)散,把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴(kuò)散而相遇,在二者比例適當(dāng)?shù)牡胤,形成肉眼可?jiàn)的沉淀弧。
該方法可以用來(lái)研究:①抗原和抗體的相對(duì)應(yīng)性;②測(cè)定樣品的各成分以及它們的電泳遷移率;③根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率,免疫特性及其它特性,可以確定該復(fù)合物中含有某種蛋白質(zhì);④鑒定抗原或抗體的純度。
試劑與器材
同瓊脂平板電泳。
操作方法
1.在玻璃板的中央放置一小玻棒(d=2mm~3mm),然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥緩
沖液配制1%瓊脂,制成瓊脂板,板厚2mm.。
2.在玻棒的兩側(cè),板中央或1/3處,距玻棒4mm~8mm各打直徑3mm~6mm的孔。
3.在孔內(nèi)加滿血清。
4.將玻璃板置電泳槽上進(jìn)行電泳。電流為2mA/cm~3mA/cm(或電壓3V/cm~6V/cm),
電泳時(shí)間4h~6h。
5.停止電泳,用小刀片在玻璃板兩側(cè)切開(kāi),取出玻璃棒,加抗血清樣品。
6.于濕盒內(nèi)37℃(或常溫)擴(kuò)散24h,取出觀察。
7.于生理鹽水中浸泡24h,中間換液數(shù)次,取出后,加0.05%氨基黑染色5min~10min,然后以1mol/L冰醋酸脫色至背景無(wú)色為止。
8.制膜、觀察、保存標(biāo)本。
免疫電泳結(jié)果分析
1.常見(jiàn)的沉淀弧 由于經(jīng)電泳已分離的各抗原成分在瓊脂中呈放射狀擴(kuò)散,而相應(yīng)的抗體呈直線擴(kuò)散,因此生成的沉淀一般多呈弧形,常見(jiàn)的弧形如下:①交叉。罕硎緝蓚(gè)抗原成分的遷移率相近,但抗原性不同;②平行。罕硎緝蓚(gè)不同的抗原成分,它們的遷移率相同,但擴(kuò)散率不同;③加寬弧:一般是由于抗原過(guò)量所致;④分枝弧:一般是由于抗體過(guò)量;⑤沉淀線中間逐漸加寬并接近抗體槽,一般由于抗原過(guò)量,在白蛋白位置處形成;⑥其它還有彎曲弧、平坦弧、半弧等。
2.沉淀弧的曲度 勻質(zhì)性的物質(zhì)具有明確的遷移率,能生成曲度較大的沉淀弧。反之有較寬遷移范圍的物質(zhì),其沉淀弧曲度較小。
3.沉淀的清晰度 沉淀線的清晰度與抗原抗體的特異性程度有關(guān),也與抗體的來(lái)源有關(guān)?寡宥鄟(lái)源于兔、羊、馬。兔抗體的特點(diǎn)是形成沉淀線寬而淡,抗體過(guò)量對(duì)沉淀線影響較小,而抗原過(guò)量,沉淀線發(fā)生部分溶解。馬抗血清所形成的沉淀線致密、清晰,抗原或抗體過(guò)量時(shí),復(fù)合物沉淀溶解、消失,而且產(chǎn)生繼發(fā)性的非特異性沉淀。因此使用抗原抗體時(shí),一定要找好適當(dāng)?shù)谋壤?/p>
4.沉淀弧的位置 高分子量的物質(zhì)擴(kuò)散慢,所形成的沉淀線離抗原孔較近;而分子量較小的物質(zhì),擴(kuò)散速度快,沉淀弧離抗體槽近一些。抗原濃度高沉淀弧偏近抗體槽,反之,抗體濃度過(guò)高,沉淀弧偏近抗原孔。
注意事項(xiàng)
1.免疫電泳分析法的成功與否,主要取決于抗血清的質(zhì)量?寡逯斜仨毢凶銐虻目贵w,才能同被檢樣品中所有抗原物質(zhì)生成沉淀反應(yīng)。
2.抗血清雖然含有對(duì)所有抗原物質(zhì)的相應(yīng)抗體,但抗體效價(jià)有高有低,因此要適當(dāng)考慮抗原孔徑的大小和抗體槽的距離。
3.免疫電泳要求分析的物質(zhì)一方為抗原,另一方為沉淀反應(yīng)性抗體。因此沒(méi)有抗原性的物質(zhì)或抗原性差的物質(zhì)、非沉淀反應(yīng)性抗體,均不能用免疫電泳進(jìn)行分析。