自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustainedsequence replication，3SR)，又稱(chēng)依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)或再生長(zhǎng)序列復(fù)制技術(shù).1990年Guatelli等首先報(bào)道了這一技術(shù).NASBA主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序.該反應(yīng)有賴(lài)于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成.
3SR反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP(核糖核苷)，兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3'末端與靶序列互補(bǔ)，5'端含T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子，這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5'未端互補(bǔ).
在3SR反應(yīng)時(shí)，首先引物Ⅰ與RNA模板復(fù)性(結(jié)合)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5'未端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子.該酶即以此DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個(gè)拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA.
其基本方法為:將引物，標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液，65℃1min使RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，降溫至37℃加入逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反應(yīng)1～1.5小時(shí)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán).整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好.
3SR反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP(核糖核苷)，兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3'末端與靶序列互補(bǔ)，5'端含T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子，這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5'未端互補(bǔ).
在3SR反應(yīng)時(shí)，首先引物Ⅰ與RNA模板復(fù)性(結(jié)合)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5'未端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子.該酶即以此DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個(gè)拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA.
其基本方法為:將引物，標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液，65℃1min使RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，降溫至37℃加入逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反應(yīng)1～1.5小時(shí)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán).整個(gè)反應(yīng)過(guò)程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好.
