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熒光標記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應用

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

 。1)細胞核的分離:將培養(yǎng)的細胞制成細胞混懸液,或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細胞。應用MgSO4染色分離方法分離細胞核(Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。細胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后,使核從細胞分離,細胞核混懸液濃度為4~5×106細胞核/ml。

 。2)細胞固定和酸的處理:在5ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心(×150g)10min。重復加三次冷的100%酒精入試管內(nèi),離心,傾去。置于冰上10min,再離心。然后加入相當核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100(IBM配方:50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再離心,重復IBM漂洗(這時細胞核可在不染色情況下,以熒光顯微鏡觀察)后,以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min,繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10min。傾去上清液,加IBm -Triton X-100漂洗,離心,使細胞核混懸液最終濃度為108/ml,(可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍,在血球計數(shù)器計數(shù)),混懸液鏡檢應含單個,完整的細胞核。

 。3)細胞核混懸液雜交

 、倥渲齐s交混合液:甲酰胺5份,20×SSC1份,50%硫酸葡聚糖2份,pH調(diào)至7.0。此原液(stock solution)可貯存在4℃冰箱內(nèi)。應用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA(herring sperm DNA)。
  ②混合1μl的細胞核混懸液(108/ml)與18μl的雜交混合液,充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中(核含量約為105)。
 、奂尤100ng/每管的AAF標記DNA探針(如為生物素標記DNA探針濃度為20~40ng/每管)。
 、苤70℃10min使DNA探針和核DNA變性。
 、莺徒M織切片與DNA探針雜交方法相較,不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應,而應迅速轉(zhuǎn)入37℃孵育過夜。

 。4)雜交后漂洗
 、僭诿抗苤屑尤1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC(pH7.0),在42℃靜置10~15min。偶爾旋轉(zhuǎn)以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞(107/ml)混勻,離心,室溫,10min,輕彈試管使沉淀的小塊散開,加入1.25ml 2×SSC(pH7.0),42℃,繼之,靜置于室溫10~15min,如前離心,再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min,離心。
  注:DEMS處理紅細胞方法:經(jīng)漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中,細胞含量為108/ml,以K2CO3和DEMS溶液處理3次,第1次:K2CO3為20mmol/L,DEMS為3mmol/L,以后2次:K2CO3依然為20mmol/L,而DEMS為10mmol/L。在應用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中,應用100mmol/l K2CO3將pH調(diào)至9~10。在25℃,15min后,加入50μl,100mmol/l 的檸檬酸(citric acid)/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。固定的紅細胞離心傾去上清液后,用2×SSC稀釋到108/ml,加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。

 。5)AFF標記的熒光顯示:加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清(NGS),輕輕振蕩混勻,室溫靜置10min,加20μl 1:100的單克隆抗AFF抗體,37℃孵育45min,加1.25ml的PBS-Tween,室溫靜置10min,加20間歇性振蕩,離心,傾去上清液,加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩,室溫靜置10min,加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標記抗血清,稀釋度1:100~1:300。孵育于37℃45min,加1.25ml PBS –Tween,室溫靜置10min,離心,傾去上清液。

 。6)生物素標記探針的熒光顯示:加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后,加20μl抗生物素標記FITC抗血清15μg/ml,孵育在37℃30min,以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次,加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10~15min,間歇振蕩、離心。

 。7)熒光顯微鏡觀察:將細胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中,輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上,選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長觀察。

 。8)流式細胞計:將750μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀(Flow cytometry, FCM),DEMS處理過的紅細胞作為對照(Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。

 
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