1.組織處理
。1)冷凍切片:厚10~20μm,貼于事先經(jīng)清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃,在應(yīng)用于雜交實驗前,使迅速回升到室溫,干燥,固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中,pH7.4。PBS漂洗5min×3,孵育在2×SSc 10min。
。2)石蠟包埋切片:浸入二甲苯10min移除石蠟,以100%乙醇10min ×2,空氣干燥10min,從高到低梯度乙醇(95%,80%,70%)1min/每個濃度。PBs 5min×3,孵育在2×SSc 10min。
(3)離心細胞涂片:將細胞先以4%多聚甲醛固定,應(yīng)用離心沉淀法,將沉淀物涂于有粘附劑的載片上,應(yīng)用PBS(含5mmol/l MgCl2)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含(0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2.探針準(zhǔn)備35pmol的寡核苷酸(oligo -)探針,3’ 終末標(biāo)記以地高辛-11–dUTP。
3.預(yù)雜交和雜交加約300μl預(yù)雜交液(配制法見附錄)在每張載片上,室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA,在應(yīng)用前須在沸水浴中加熱10min,而對酵母tRNA可不用加熱變性。
(1)應(yīng)用預(yù)雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的Oligo-探針,探針理想工作濃度根據(jù)于待測核苷酸含量和實踐的結(jié)果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探針,其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
(2)預(yù)雜交后以2×SSC漂洗,以吸水紙拭干切片周圍水份,加30μl雜交液在切片上,加硅化蓋玻片,在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h,1×SSC漂洗切片1h(室溫),0.5×SSc 37℃洗半小時,0.5×SSC室溫漂洗半小時。
4.地高辛顯示。