一、顯微切割技術(shù)出現(xiàn)的背景

在分子病理學(xué)研究中，常常遇到兩個(gè)比較棘手的問(wèn)題：

一是選取的研究材料需要在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同質(zhì)性。我們?nèi)梭w的各種組織絕大多數(shù)是由多種不同細(xì)胞組成的異質(zhì)性的細(xì)胞群，這種選取同質(zhì)性的研究材料問(wèn)題在對(duì)人體組織的深入研究中常常遇到卻又不易解決；

二是隨著研究的不斷深入需要在組織細(xì)胞中分離的研究材料日趨微小，常規(guī)手段往往不易做到。

顯微切割技術(shù)（microdissection technique）可以很好地解決以上問(wèn)題，因而受到高度重視并得以廣泛應(yīng)用。

二、什么是顯微切割技術(shù)

1. 定義

顯微切割技術(shù)是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下通過(guò)顯微操作系統(tǒng)對(duì)欲選取的材料（組織，細(xì)胞群，細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等）進(jìn)行切割分離并收集用于后續(xù)研究的技術(shù)。顯微切割技術(shù)實(shí)際上屬于在微觀領(lǐng)域?qū)ρ芯坎牧系姆蛛x收集技術(shù)，因此應(yīng)用此技術(shù)往往是許多要深入的研究工作中起始的重要一步。

2. 顯微切割的四個(gè)特點(diǎn)：

一是“細(xì)微”，由于是在顯微狀態(tài)并采用特殊的分離收集手段，顯微切割的對(duì)象可以達(dá)到微米級(jí)，顯微切割的精度可以達(dá)到毫微米級(jí)，因此利用顯微切割技術(shù)可以分離收集到象核仁和包涵體及染色體特異區(qū)帶這樣細(xì)微的對(duì)象；

二是“原位”，利用顯微切割技術(shù)是在組織細(xì)胞或染色體的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究對(duì)象的歷史背景明確。

三是“同質(zhì)”，顯微切割技術(shù)可以保證所取材料一定層次上的同質(zhì)性。

四是“結(jié)合”，顯微切割技術(shù)可以與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合使用。

正是由于顯微切割技術(shù)具有上述特點(diǎn)或者稱為優(yōu)勢(shì)，其在分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用十分廣泛。

3. 顯微切割的方式

依其發(fā)展的過(guò)程可以分為以下四種：手動(dòng)直接顯微切割、機(jī)械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光捕獲顯微切割（Laser Capture Microdissection）。

A、手動(dòng)直接顯微切割是早期的切割方式，它是直接在顯微鏡下手持切割用針?lè)蛛x組織或細(xì)胞群，此種方式切割精度低，只適用于對(duì)較大塊組織中的局部區(qū)域或細(xì)胞群進(jìn)行分離，切割單個(gè)細(xì)胞十分困難；

B、機(jī)械輔助顯微切割是利用普通光學(xué)顯微鏡的微調(diào)旋鈕控制切割針切割細(xì)胞，可采用30G1/2注射用針替代需要專用拉絲設(shè)備制作的玻璃切割針，此方式切割精度較手動(dòng)直接顯微切割的精度有了提高，可以達(dá)到對(duì)較大的單個(gè)細(xì)胞的切割，而且此方式簡(jiǎn)單易行低耗，尤其適合于基層和無(wú)專用設(shè)備的單位，但由于顯微鏡的微調(diào)旋鈕只能進(jìn)行二微控制，對(duì)切割后的細(xì)胞進(jìn)行收集較為困難，且切割精度仍然較低；
C、液壓控制顯微切割是采用液壓式顯微操縱系統(tǒng)配合倒置顯微鏡進(jìn)行顯微切割，目前常用的操縱系統(tǒng)有日本的Narishige和德國(guó)的Eppendorf液壓顯微操縱系統(tǒng)，該系統(tǒng)同時(shí)可用在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及顯微注射等實(shí)驗(yàn)中，它通過(guò)液壓系統(tǒng)可提供X軸、Y軸和Z軸三個(gè)方向的精確的三微控制，其切割精度是目前各種方式中最高的，也是很多實(shí)驗(yàn)室常用的方法，其不足是不能實(shí)現(xiàn)顯微切割的自動(dòng)化，要收集較大量的目的組分時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)，效率低；

D、激光捕獲顯微切割是目前最為先進(jìn)的方式，它快速方便，可從大量的研究材料中迅速捕獲較多的目的組分，自動(dòng)化程度高，但這需要昂貴的專用設(shè)備。

4. 顯微切割的材料

顯微切割的材料可以是以各種方式貼附于固相支持物上的各種組織細(xì)胞成分，其來(lái)源十分廣泛，石蠟組織切片、冰凍組織切片、細(xì)胞鋪片、細(xì)胞爬片、細(xì)胞甩片、培養(yǎng)細(xì)胞、常規(guī)制備的染色體等均可采用。具體選擇何種材料根據(jù)研究目的的不同進(jìn)行，如果顯微切割后需要進(jìn)行RNA分析則通常采用冰凍組織切片或新制備的細(xì)胞片；在回顧性研究中福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片應(yīng)用最為廣泛。

5. 顯微切割的結(jié)合技術(shù)

顯微切割時(shí)究竟選擇什么樣的細(xì)胞完全取決于研究的目的，但如何識(shí)別欲切割的細(xì)胞及如何對(duì)已切割的細(xì)胞進(jìn)行分析，則需要和其它方法相結(jié)合。正是由于能與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用使顯微切割技術(shù)顯示出蓬勃的生命力。根據(jù)研究的需要可在顯微切割前應(yīng)用組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、原位末端標(biāo)記、原位PCR、FISH、組織特染等方法對(duì)需要切割的組織內(nèi)成分進(jìn)行標(biāo)記，顯微切割后獲得的材料可以用于提取蛋白質(zhì)、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白質(zhì)和核酸的相關(guān)分析。

三、顯微切割的影響因素

由于顯微切割常常是與多種方法結(jié)合使用，影響顯微切割實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的因素也就多種多樣。這就需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中把握一個(gè)原則，即一切與顯微切割結(jié)合的技術(shù)中影響因素應(yīng)同時(shí)列為顯微切割實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果的影響因素，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中予以考慮。與不同的方法結(jié)合決定了需要對(duì)顯微切割的材料進(jìn)行不同的處理，運(yùn)用顯微切割技術(shù)時(shí)應(yīng)該分離多少細(xì)胞或亞細(xì)胞才能滿足實(shí)驗(yàn)研究的需要，這要受多種因素的影響.在不影響形態(tài)觀察的前提下，作為顯微切割的組織切片越厚越好。分析基因組DNA時(shí)，細(xì)胞越大，則需要切割更多的細(xì)胞，才能保證包含細(xì)胞的全部基因組。

四、顯微切割的最新進(jìn)展

顯微切割技術(shù)的進(jìn)展主要體現(xiàn)在激光捕獲顯微切割技術(shù)的廣泛應(yīng)用，此項(xiàng)顯微切割技術(shù)開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞分離技術(shù)的新紀(jì)元。借助于這一革命性技術(shù)，我們可以快速地精確識(shí)別和特異分離單個(gè)或群體細(xì)胞用于進(jìn)行下一步的細(xì)胞及分子生物學(xué)研究，其精確識(shí)別是在顯微鏡下通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、免疫組織化學(xué)染色及組織化學(xué)染色等方法并有計(jì)算機(jī)輔助實(shí)現(xiàn)，而特異分離則是通過(guò)低能量紅外激光及專用的細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜實(shí)現(xiàn)。激光捕獲顯微切割是通過(guò)激光顯微細(xì)胞分離系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，該系統(tǒng)由倒置顯微鏡、紅外激光發(fā)射器、真空泵、細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜及計(jì)算機(jī)組成。通過(guò)顯微鏡載物臺(tái)中真空泵固定載玻片，通過(guò)附著在離心管蓋底的超薄細(xì)胞轉(zhuǎn)移膜將由紅外激光分離挑選出的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，并可以直接被離心管中的提取液所溶解和提取，其提取液的性質(zhì)可以根據(jù)您所提取的細(xì)胞組分而自行決定，而且所有的細(xì)胞分離過(guò)程，無(wú)論是轉(zhuǎn)移操作還是保存樣品，都無(wú)需任何手工操作，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)污染的細(xì)胞分離。近年來(lái)，激光捕獲顯微切割技術(shù)在分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用不斷深入，特別是在腫瘤基因突變檢測(cè)、腫瘤特異基因表達(dá)分析、雜和性丟失檢測(cè)、微衛(wèi)星序列不穩(wěn)定性分析、新基因發(fā)現(xiàn)、核酸及蛋白質(zhì)的定量研究、染色體畸變分析、細(xì)胞局部病變病因?qū)W研究等多種領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛應(yīng)用，取得了許多本技術(shù)誕生前無(wú)法實(shí)現(xiàn)的新研究成果。