（1）DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。
　�。�2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑：
　　新鮮變性的DNA 　　　　　　　　　1-3μg
　　六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl（管5）
　　dNTP標(biāo)記用混合底物 　　　　　　　2μl（管6）
　　加無菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl
　　DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　1μl（管7）
　　（3）在37℃保溫至少60min，可到20h。
　�。�4）煮沸5min，終止反應(yīng)。
　�。�5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。

　　2．預(yù)雜交　按100cm2膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。
　　預(yù)雜交液組成：5×SSC
　　0.5%（W/V）封阻試劑（管11）
　　0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
　　0.02%（W/V）SDS
　　膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過夜。

　　3．雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。
　　雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V）
　　5%（W/V）封阻試劑
　　5×SSC
　　0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉
　　0．02%(W/V)SDS
　　新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml）

　　雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。

　　4．洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液計(jì)算。
　�。�1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。
　�。�2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。
　�。�3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

　　5．免疫測(cè)定

　�。�1）配制溶液
　　緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃）
　　緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。
　　緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。
　　緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)
　　顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。

　　2． 顯色過程
　　A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。
　　B．在100ml緩沖2中保溫30min。
　　C．再用緩沖液1短暫洗滌。
　　D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。
　　E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。
　　F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。
　　G.膜在緩沖液3中平衡2min。
　　H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí)，不可振蕩或攪拌。
　　I．當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測(cè)時(shí)，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。
　　J．?dāng)z相。
　　說明：上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。

　　（五）排除實(shí)驗(yàn)中問題的方法

　　1．DNA不能有效地被標(biāo)記時(shí)考慮
　�。�1）用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。
　�。�2）標(biāo)記反應(yīng)的保溫時(shí)間延長(zhǎng)（增至20h）。
　　（3）DNA變性或許不完全，這時(shí)對(duì)大片段DNA特別重要。

　　2．不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時(shí)考慮
　�。�1）DNA標(biāo)記率。
　　（2）增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時(shí)間。
　�。�3）顯色反應(yīng)的時(shí)間可延長(zhǎng)至3d。

　　3．若顯色時(shí)背景過深，可采取
　�。�1）在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。
　�。�2）增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。
　�。�3）某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。
　�。�4）在雜交和檢測(cè)過程中增加封阻試劑的濃度。