手機(jī)版
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模后w外檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用。用于驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。
實(shí)驗(yàn)原理：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過(guò)GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。
試劑：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分裝)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）
實(shí)驗(yàn)操作程序：
材料及試劑
探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細(xì)胞蛋白，或者組織蛋白提取物
細(xì)胞蛋白裂解液，洗脫液：
PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl： 8g
KCl： 0.2g
Na2HPO4： 1.44g
KH2PO4： 0.24g
加入800ml蒸餾水，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存?zhèn)溆茫?/div>
PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲(chǔ)存濃度100mM，將0.174g PMSF溶于10ml無(wú)水乙醇混勻即可！保持于-20℃或者4℃
（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過(guò)表達(dá)蛋白B相互作用）
1：原核融合蛋白A的獲得
1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)粒化轉(zhuǎn)BL21(DE3)菌株
1.2：挑取單個(gè)克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養(yǎng)過(guò)夜
1.3：將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細(xì)菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置O/N
1.4：室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細(xì)菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻
1.5：冰上超聲破碎，開(kāi)2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼
1.6：11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清， -80℃保存?zhèn)溆?/div>
2：真核融合蛋白B的獲得
2.1：將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達(dá)載體上，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染
3：48小時(shí)后，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融
4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤(rùn)洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時(shí)。
5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。
6：同時(shí)，裂解真核融合蛋白B，去盡培養(yǎng)基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。
7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。
8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補(bǔ)足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測(cè)。用HA或者myc Blot。
編輯：songjiajie2010
分享:
關(guān)鍵詞：
GST-pulldown操作流程
