張寧1,2，林洪1*， 隋濤2，鐘響2，張藝兵3
(1.中國(guó)海洋大學(xué)水生生物制品安全性實(shí)驗(yàn)室，青島 266003；2. 煙臺(tái)檢驗(yàn)檢疫局，煙臺(tái) 264000；3. 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，青島 266001)
摘要：牡蠣是我國(guó)出口量較大的水產(chǎn)品之一，由于產(chǎn)品本身的特殊性，在生長(zhǎng)過程中易產(chǎn)生腹瀉性貝毒（DSP）。本實(shí)驗(yàn)中原料牡蠣DSP生物法檢測(cè)結(jié)果為陰性，冷凍貯存4個(gè)月后檢測(cè)結(jié)果即為陽性。本研究以分析這一變化原因?yàn)槟康�，采�?/span>LC-MS法對(duì)DSP生物檢測(cè)的陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果表明，生物法DSP檢測(cè)的結(jié)果為假陽性，造成生物法DSP檢測(cè)中小白鼠死亡的是牡蠣在貯藏過程中產(chǎn)生的脂溶性有毒物質(zhì)。通過進(jìn)一步分析，最終確定該有毒物質(zhì)的成分為牡蠣脂肪水解物-游離脂肪酸。同時(shí)本研究對(duì)牡蠣在不同貯存溫度和貯存時(shí)間下產(chǎn)生的游離脂肪酸含量進(jìn)行測(cè)定，在-10℃貯存溫度下，貯存0、2、4、6、8、10個(gè)月，游離脂肪酸的變化范圍為5.2-788.6 mg/kg；在-10℃，-18℃，-25℃貯存溫度下，貯存4個(gè)月，游離脂肪酸的變化范圍為389-92.5 mg/kg。
關(guān)鍵詞：冷凍 牡蠣 貯存 游離脂肪酸 有毒物質(zhì)
中圖分類號(hào)：S984.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
Research on Fat-soluble Toxicant in Stored Frozen Oyster
（Zhang Ning1,2, Lin Hong1, Sui Tao2, Zhong Xiang2, Zhang Yi Bing3）
(1.Seafood Safety Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003; 2.Yantai Inspection And Quarantine Bureau,Yantai,264000; 3.Shangdong Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Qingdao 2660010)
Abstrats: Oyster is the larger exports of aquatic products in our country. Due to the specificity of the products, diarrhetic shellfish poisoning (DSP) was easy to enrich in the growth process. In this experiment, DSP biological test results are negative in raw oysters, but positive when it was in frozen storage for four months. The purpose of our research was to analysis this change. LC-MS method was used for biological detection of DSP-positive samples. It confirmed that DSP biological detection was false-positive results, which led to mice died in biological detection of DSP was the fat-soluble toxic substances produced in the process of oysters frozen storage. Through further analysis, the toxic substances was the hydrolyzate of oyster fat -free fatty acids(FFA).At the same time, FFA of oyster were determined at different storage temperature and storage time. FFA changed in the range of 5.2-788.6mg/kg for stored 0,2,4,6,8,10 months at -10℃; FFA changed in the range of 389-92.5 mg / kg for stored 4 months at -10℃, -18℃, -25℃.
Keywords: frozen; oyster; storage; free fatty acids；toxicant
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作者簡(jiǎn)介：張寧（1970-11）女, 山東煙臺(tái)人, E-mail:ytciqzn@tom.com
通訊作者：張寧，Tel:13605356802
2004年以來，我國(guó)出口日本的冷凍牡蠣產(chǎn)品不斷地被日方通報(bào)檢出腹瀉性貝毒(DSP)。通過調(diào)研了解到，被日本通報(bào)的牡蠣產(chǎn)品均為冷凍裹面包粉牡蠣。帶殼原料牡蠣收獲季節(jié)為11月份至第二年的4月份，由于日本裹粉牡蠣大多在春季末形成消費(fèi)高峰，因此帶殼牡蠣須經(jīng)去殼冷凍成為半成品后進(jìn)行冷藏備用，加工前進(jìn)行貝毒檢測(cè)。由于貝毒在產(chǎn)品的加工、貯存過程中不會(huì)有變化，因此加工企業(yè)在出口時(shí)通常不再進(jìn)行貝毒檢測(cè)。通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，被日本通報(bào)的牡蠣產(chǎn)品在收購(gòu)原料或半成品時(shí)都進(jìn)行了貝毒檢測(cè)，合格后再進(jìn)行加工，正常情況下成品不應(yīng)該出現(xiàn)貝毒陽性的情況。為此，本文對(duì)牡蠣產(chǎn)品貝毒檢測(cè)陽性的原因進(jìn)行調(diào)查研究，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析、控制，以期探討牡蠣產(chǎn)生有毒物質(zhì)的原因。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備
新鮮牡蠣，去殼后于冷藏庫(kù)冷凍，鮐魚、馬哈魚，脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品：C12:0，C14:0，C16:0，C16:1，C18:0，C18:1, C18:2，C20:5，C22:4，C22:6（Sigma），氫氧化鈉，丙酮，硫酸，乙醚，吐溫-60（均為化學(xué)純），正己烷（色譜純），甲醇（色譜純），
GC6890N氣相色譜儀（Agilent），配FID檢測(cè)器，INNOWAX石英毛細(xì)管柱，檢測(cè)條件：檢測(cè)器溫度：250℃，柱溫：初溫80℃，以15℃/min升至230℃，保持14min，載氣：氮?dú)�，流量�?.5mL/min，尾吹氣流量：40mL/min，空氣流量：450mL/min，氫氣流量：40mL/min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；均質(zhì)器；注射器；
昆明系雄性小白鼠（體重16-20g）。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1牡蠣中脂溶性物質(zhì)的提取方法
取200g均勻樣品放入均質(zhì)杯，加入3倍量丙酮均質(zhì)2min。用布氏漏斗抽濾并收集濾液。對(duì)殘?jiān)詸z樣兩倍量再抽濾兩次，合并抽濾液。對(duì)抽濾液減壓濃縮去除丙酮。用100mL乙醚和20ml的水洗濃縮物，輕輕震蕩，靜置分層后去除水層,定容至200mL。
1.2.2 游離脂肪酸（FFA）的測(cè)定
1.2.2.1 Amberlyst-26(A-26)陰離子交換樹脂的處理：
稱取5g A-26樹脂加入50mL 0.5mol/L的NaOH溶液，振搖30min后傾去NaOH液，依次用去CO2蒸餾水和甲醇洗3次，每次振搖20min，重復(fù)處理一次后將A-26樹脂保存于甲醇中。
1.2.2.2 游離脂肪酸的測(cè)定
取1.2.1中牡蠣中提取液2mL于具塞三角瓶中，加入15mL丙酮-甲醇（2：1）溶液，加入200mg樹脂，以120r/min水平振搖30min，靜置除去溶劑，用丙酮-甲醇溶液洗滌樹脂5次（共15mL），室溫下氮?dú)獯蹈蓸渲⑥D(zhuǎn)移至干試管中，加入1mL1%硫酸、2mL甲醇，70水浴30min，充分冷卻后加入2mL正己烷、1mL蒸餾水，振搖至兩相清晰，取1µL正己烷層進(jìn)行氣譜分析
1.2.3牡蠣脂類提取液毒性研究
1.2.3.1脂肪提取液注射液制備
1.2.1提取液200mL，在茄形瓶減壓濃縮去除乙醚，濃縮物以少量乙醚溶解后再次減壓濃縮去除乙醚，所得濃縮物用1%吐溫60生理鹽水定溶至10mL。
1.2.3.2 SN0294-93 貝類腹瀉性貝毒檢驗(yàn)方法（生物法）
2 結(jié)果與分析
2.1 DSP陽性確認(rèn)
對(duì)半成品牡蠣及貯藏5個(gè)月的牡蠣進(jìn)行DSP測(cè)定。測(cè)定結(jié)果見表1。
表1 不同測(cè)定方法測(cè)定牡蠣中DSP
Table 1 The results of DSP by different methods
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半成品牡蠣
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貯藏5個(gè)月牡蠣
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生物法
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陰性
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陽性
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LC-MS
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陰性
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陰性
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目前，用于DSP檢測(cè)的方法主要有小鼠腹腔注射法（生物法）、酶聯(lián)免疫法、細(xì)胞毒性測(cè)試法、HPLC以及LC-MS等方法。其中生物法和HPLC使用較多。在生物法中，由于DSP的提取過程復(fù)雜，易受雜質(zhì)干擾，假陽性結(jié)果時(shí)有出現(xiàn)[1]。因此我們采用準(zhǔn)確度較高的LC-MS 作為驗(yàn)證方法。
生物法進(jìn)行DSP檢測(cè)方法的主要原理是采用有機(jī)溶劑對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行萃取，經(jīng)提純濃縮后加入吐溫溶解后進(jìn)行小白鼠腹腔注射，根據(jù)小白鼠的死亡情況判定被檢樣品是否含有DSP。因此生物法DSP檢測(cè)的實(shí)際上是脂溶性有毒物質(zhì)。通過表1的結(jié)果，我們可以判定造成生物法DSP檢測(cè)中小白鼠死亡的不是DSP，而是牡蠣在貯藏過程中產(chǎn)生的其他物質(zhì)導(dǎo)致生物法DSP檢測(cè)的假陽性。
為了進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，我們又選取了含脂肪較多的鮐魚、馬哈魚進(jìn)行驗(yàn)證。
取冷凍一個(gè)月及經(jīng)過兩年冷凍貯存的鮐魚、馬哈魚，按生物法DSP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間貯存的水產(chǎn)品也能造成小鼠死亡（表2）。由于魚類本身不可能含有DSP，因此判定DSP結(jié)果實(shí)際為假陽性。
冷凍造成牡蠣組織結(jié)構(gòu)不同程度上的破壞，這些變化以不同的方式影響組織內(nèi)酶的活性，造成冷凍產(chǎn)品成分發(fā)生改變[2]。陳慧斌[3]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，去殼牡蠣容易遭受微生物的侵染，而微生物的作用加劇了牡蠣脂肪的變化。
表2 不同種類的水產(chǎn)品DSP檢測(cè)結(jié)果（以小白鼠死亡與否衡量）
Table 2 The DSP results of different seafood
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貯存時(shí)間
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鮐魚
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馬哈魚
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一個(gè)月
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不死亡
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不死亡
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兩年
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死亡
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死亡
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牡蠣中存在較多的脂肪，這部分脂肪在貯存過程中可能發(fā)生水解和氧化反應(yīng)，產(chǎn)生游離脂肪酸及進(jìn)一步的氧化產(chǎn)物，最終可導(dǎo)致牡蠣嚴(yán)重酸�。ㄓ蜔┦ナ秤脙r(jià)值[4]。在隨后對(duì)游離脂肪酸毒性研究中發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸對(duì)小白鼠進(jìn)行腹腔注射時(shí)表現(xiàn)的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)其進(jìn)行口服時(shí)的毒性。徐正婕等人[5]也提出游離脂肪酸能夠造成動(dòng)物的肝損傷，導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物的肝細(xì)胞凋亡和肝纖維化。因此，牡蠣中脂肪最初分解的產(chǎn)物游離脂肪酸就會(huì)對(duì)小白鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，即貯存的牡蠣半成品在產(chǎn)生明顯酸敗前已表現(xiàn)為生物法DSP檢測(cè)結(jié)果的陽性。
2.2 游離脂肪酸的測(cè)定結(jié)果
圖1為多種游離脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)圖譜，圖2為原料牡蠣脂肪酸圖譜, 圖3為 -18℃牡蠣貯存六個(gè)月后游離脂肪酸圖譜。Toru Takagi[6]就純游離脂肪酸的毒性進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種類的脂肪酸其毒性差異很大, C20:4 n-6、C18:3 n-3、C20:5 n-3表現(xiàn)出高毒性，C18:2 n-6、C18:4 n-3、C22:6 n-3表現(xiàn)出低毒性，C18:1 n-9表現(xiàn)出弱毒性，在貝類中主要的有毒游離脂肪酸為EPA(C20:5n-3)。本實(shí)驗(yàn)通過比較研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣在不同貯存條件下產(chǎn)生的各種游離脂肪酸的比例大致相同，我們選取C20:5作為游離脂肪酸代表性檢測(cè)指標(biāo)（下同）。
2.2.1同一溫度不同貯存時(shí)間游離脂肪酸的測(cè)定結(jié)果
在-10℃貯存條件下，取0個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、10個(gè)月的樣品進(jìn)行游離脂肪酸檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見表4。
2.2.2不同溫度同一貯存時(shí)間游離脂肪酸的測(cè)定結(jié)果
在-10℃、-18℃、-25℃條件下貯存四個(gè)月，進(jìn)行游離脂肪酸檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見表5。
對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，牡蠣貯存過程中游離脂肪酸變化情況為：在貯存溫度相同的條件下，牡蠣中游離脂肪酸含量隨貯存時(shí)間的增加而升高（表4）；在相同貯存時(shí)間中，牡蠣中游離脂肪酸含量隨貯存溫度的升高而升高（表5）。
圖1 游離脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)圖譜
Fig.1 Chromatogram of standard FFA
圖2 原料牡蠣中游離脂肪酸圖譜
Fig.2 Chromatogram of FFA in raw oyster
圖3 -18℃牡蠣貯存六個(gè)月后游離脂肪酸圖譜
Fig.3 Chromatogram of oyster FFA for 6 months at -18℃
表4 不同貯存時(shí)間下牡蠣FFA(C20:5 n-3)含量
Table4 The content of FFA in Oyster at different reserved time
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貯存溫度
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貯存時(shí)間
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游離脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
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-10℃
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0個(gè)月
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5.2
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-10℃
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2個(gè)月
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257.9
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-10℃
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4個(gè)月
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389.0
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-10℃
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6個(gè)月
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506.5
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-10℃
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8個(gè)月
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645.3
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-10℃
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10個(gè)月
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788.6
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表5不同貯存溫度下牡蠣FFA含量
Table5 The content of FFA in Oyster at different reserved temperature
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貯存溫度
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貯存時(shí)間
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游離脂肪酸含量(mg/kg)
(C20:5 n-3)
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-10℃
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4個(gè)月
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389
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-18℃
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4個(gè)月
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238.4
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-25℃
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4個(gè)月
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92.5
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2.3牡蠣脂類提取液毒性測(cè)定結(jié)果
表6為-10℃下5個(gè)不同貯存時(shí)間的牡蠣脂肪提取液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射時(shí)的平均致死時(shí)間。從結(jié)果可看到，牡蠣貯存時(shí)間越長(zhǎng)，小鼠腹腔注射的平均致死時(shí)間越短，說明其提取液的毒力越強(qiáng)。
表6不同貯存時(shí)間小鼠的平均致死時(shí)間(-10℃)
Table.6 The average terminal time of rats at different reserved time(-10℃)
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貯存時(shí)間
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平均致死時(shí)間（h）
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0個(gè)月
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未死亡
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2個(gè)月
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24
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4個(gè)月
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20
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6個(gè)月
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15
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8個(gè)月
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12
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3 討論
新鮮牡蠣干粉中脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為 l1.5％，脂肪中含有豐富的n-3多不飽和脂肪酸，特別是 DHA與 EPA約占脂肪酸總量的25%[7]。牡蠣在貯藏期間脂肪主要發(fā)生氧化和水解兩種形式的變化[8]。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究的牡蠣產(chǎn)品，由于其在貯存過程中有塑料袋密封冷凍保存，屬于相對(duì)缺氧的環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)迪犞驹谫A存條件下發(fā)生的主要是水解變化，產(chǎn)物主要為游離脂肪酸。目前生產(chǎn)企業(yè)、檢驗(yàn)檢疫部門等進(jìn)行DSP檢測(cè)時(shí)一般采用生物法，即檢測(cè)牡蠣產(chǎn)品中的脂溶性有毒物質(zhì)。游離脂肪酸經(jīng)腹腔給小白鼠注射后會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，從而導(dǎo)致生物法檢測(cè)牡蠣中DSP時(shí)產(chǎn)生假陽性。
此外游離脂肪酸對(duì)小白鼠檢測(cè)結(jié)果有很大影響，其影響大小不單與量的多少有關(guān)，其組成的不同，結(jié)果差異也很大。體外細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)，富含多不飽和脂肪酸的乳糜微粒對(duì)單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性最強(qiáng)，而富含單不飽和及飽和脂肪酸的乳糜微粒幾乎無或很少有毒性[9]。富含油酸、亞油酸等多不飽和脂肪酸的玉米油、魚油可促進(jìn)酒精、四氯化碳引起的大鼠肝損傷，而富含棕櫚酸等飽和脂肪酸的棕櫚油則可逆轉(zhuǎn)酒精所致肝損傷[10,11]。其原因?yàn)椴伙柡椭舅峥杉せ罡蝺?nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且其常優(yōu)于飽和脂肪酸合成磷脂和TG，從而改變肝內(nèi)蓄積TG的組成及其對(duì)氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化損傷的敏感性。而飽和脂肪酸則可減少環(huán)氧合酶及TNFα的含量，抗脂質(zhì)過氧化，并抑制肝組織對(duì)不飽和脂肪酸的攝取。實(shí)驗(yàn)中牡蠣樣品1g中僅有幾毫克的游離脂肪酸也可顯出毒性，但其最終的毒性與過氧化物的影響有復(fù)雜的聯(lián)系，目前還沒有實(shí)際的關(guān)于貝類的特定指標(biāo)與小白鼠實(shí)驗(yàn)毒性之間相關(guān)的報(bào)告。
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《冷凍牡蠣貯存過程中脂溶性有毒物質(zhì)的變化研究》.doc